髓样白血病因子（MLF）在日本囊对虾抗病毒抗细菌免疫中的功能研究

发布时间：2020-05-22 06:30

【摘要】：1.MLF通过促进血细胞凋亡来减少WSSV复制MLF在发育、细胞周期、分化和调节RUNX转录因子方面有着重要的功能。然而,MLF在免疫方面的功能还不是很清楚。在本研究中,我们从日本囊对虾中鉴定出一种MLF,并命名为日本囊对虾MLF(MjMLF)。MjMLF全长序列包含1111个核苷酸:包括由816个核苷酸组成的开放阅读框,其中编码含有272个氨基酸的MLFIP结构域。在转录水平上,MjMLF普遍分布在日本囊对虾的多种组织中。表达模式分析说明当白斑综合征病毒刺激日本囊对虾时,MLF在对虾肝胰腺和血细胞中上调表达。RNA干扰实验和过表达(重组蛋白注射)实验说明MjMLF能够抑制白斑综合征病毒在对虾体内复制。流式细胞技术结果表明MjMLF能够促进对虾血细胞的凋亡。所有实验结果揭示MjMLF在日本囊对虾抵制病毒入侵方面起到非常关键的功能。MjMLF作为一种新的调节分子参与降低对虾WSSV复制。2.MLF通过调节抗菌肽表达来抵制鳗弧菌的入侵MLF在发育、细胞周期中有重要作用。在人类中关于MLF的研究发现是MLF在细胞周期中主要依赖P53发挥作用。在小鼠中,研究发现MLF可通过从细胞质移位到细胞核发挥功能。我们发现MLF能够抑制日本囊对虾体内的白斑综合征病毒复制。然而,MLF在细菌免疫方面的功能还不清楚。在本研究中,我们发现当对虾受到鳗弧菌刺激时,MjMLF在血细胞、鳃丝和肠组织中上调表达。MjMLF参与对虾血淋巴中的细菌清除,有益于对虾的存活。MjMLF还可参与调控多种抗菌肽的表达。体外pull-down实验发现MjMLF能够结合Mj 14-3-3。这些结果说明MLF在对虾抵制细菌入侵中扮演着重要角色。
【图文】：

序列,基因库,序列分析

kx：ＭＬＦ核苷酸全长序列含１１１１邋ｂｐ的核酸，包含有８１６邋ｂｐ的开放阅读逡逑框。开放阅读框序列编码２７２个氨基酸，，预测其相对分子质量是３０．６７，等电点逡逑是１０．０４邋（图２．１Ａ）。kxＭＬＦ蛋白质中有一个ＭＬＦＩＰ结构域（Ｆｉｇ．２．１Ｂ）。氨基酸逡逑序列比对表明对虾岭ＭＬＦ与油菜子叶蜂（４６．０４％相似性）、金小蜂（４２．０３％的逡逑相似性）、佛罗里达木蚁（４２．２１％的相似性）和果蝇（３２．６７％的相似性）有很高逡逑的序列相似性（Ｆｉｇ．邋２．２）。序列比对结果表明人、家鼠、果蝇、油菜子叶蜂、金逡逑小蜂、佛罗里达木蚁和日本囊对虾的ＭＬＦ在ＭＬＦＩＰ结构域处是非常保守的（图逡逑２．２）。逡逑我们收集了不同动物的ＭＬＦ序列做进化树分析。从图２．３中可以看出，进逡逑化树可分为两亚枝：一枝是节肢动物，另一枝则是哺乳动物。邱＿ＭＬＦ与黑腹果逡逑蝇、橄榄石蝇和}P小石蝇定位在一个亚枝。结果表明对虾kxＭＬＦ是ＭＬＦＩＰ家族逡逑１２逡逑

转录水平,对虾,血细胞,肝胰腺

在ｍＲＮＡ水平上，我们用半定量ＲＴ－ＰＣＲ实验研究对虾的组织分布逡逑情况。在正常对虾的血细胞、心、肝胰腺、鳃丝、胃和肠中都能检测到逡逑（图２．４Ａ）。结果表明Ｖ／ＭＬＦ普遍分布在对虾的多种组织中。逡逑我们用ｑＲＴ－ＰＣＲ检测分析了邋ＷＳＳＶ刺激的对虾血细胞和肝胰腺中逡逑的表达模式。图２．４Ｂ结果显示在血细胞中，当病毒刺激１２邋ｈ时，ZfＭＬＦ表达显逡逑著性上升。而在肝胰腺中，表达水平也呈现上调趋势，在６邋ｈ到７２邋ｈ表逡逑达水平均呈现上调趋势（图２．４Ｃ）。这些结果表明，在ＷＳＳＶ刺激的对虾两种免逡逑疫组织（血细胞和肝胰腺）中，Ｍ／ＭＬＦ表达能被诱导表达。这些结果暗示ＭＬＦ逡逑可能参与对虾的抗病毒免疫。逡逑Ａ逦Ｂ逦Ｃ逡逑ｉｊ邋２５邋ｈｅｍｏｃｙｔｅｓ逦＾逦ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ逦Ｅ３逦Ｎｏｒｍａｌ逡逑５逦ｒ－ｒ－１逦，逦ｓ邋４￣｜逦ＣＤ邋ＰＢＳ逡逑求？２0－逦气逦Ｅ邋ｐｂｓ＂逦ｒ逦＆逦ａｗｓｓｖ逡逑艺逦ｐＨ逦Ｏ邋ＷＳＳＶ逦０逦３－＾逦－Ｊ－逡逑赢／／１：逡逑卜逦ｒ－ｉｎ邋Ｉｎ邋ｎ邋ｎｌ逡逑ＥＢＢＨＨＢｒａｄＣ（，ｎ邋＾逦ｒ－，邋＼邋ｉｉ邋Ａ邋ｒｉ—邋ｒｉ邋一邋§邋0邋１邋Ｉｆｌ邋１邋１１１邋ｆｌ邋Ｍ邋１邋１Ｗ邋Ｉ邋１ＩＩ邋Ｍｉｌ逡逑ｊ＊．邋ｕ邋Ｉ邋￣邋ｉ逦￣￣邋ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦＾逦ｕ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逦ｉ逡逑＾逦０逦６逦１２逦２４逦４８逦７２逦￡逦０逦６逦１２逦２４逦４８逦７２逡逑Ｔｉｍｅ邋ｐａｓｔ邋ＷＳＳＶ邋ｃｈａｌｌｅｎｇｅ邋（ｈ）逦Ｔｉｍｅ邋ｐａｓｔ邋ＷＳＳＶ邋ｃｈａｌｌｅｎｇｅ邋（ｈ）逡逑图２．４．邋Ａｆ／ＭＬ尸在转录水平上的表达模式分析。（Ａ）
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S945.4

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