金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原病理学及防治药物的筛选

发布时间：2020-05-22 10:54

【摘要】：金乌贼(Sepia esculenta),别称乌鱼、墨鱼、乌子等,隶属软体动物门(Mollusca)乌贼目(Sepioidea)、乌贼科(Sepiidae)、乌贼属(Sepia),是我国北方海域中经济价值最大的乌贼和重要的捕捞对象~([1-3])。自20世纪80年代以来,受到海洋环境的污染和过度捕捞的影响,其资源量明显衰退,产量急剧下降,目前金乌贼在许多海域已经绝迹~([4-6])。为满足增殖放流和资源恢复的需求,我国从进入21世纪开始研究金乌贼繁殖技术并于2007年取得重要突破,金乌贼的增养殖业得到快速发展。随着其繁殖技术的突破,其增养殖产业迅猛发展,但对于该物种的病害研究尚未见相关报道。本文以青岛市黄岛区某育苗场人工繁育的金乌贼幼体所发生的大规模坏死病为例,从病原学、病理学、病原菌的传染途径分析及药物筛选进行了相关的研究。阐述了该疾病发生的原因,组织病理变化及针对此疾病病原菌的防控药物筛选。旨在为我国金乌贼病害防控及增养殖产业健康发展提供基础数据和理论参考。所得结果如下:1、金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原病理学研究该疾病的临床症状表现为:金乌贼幼体体色发黑,不摄食,生长缓慢;体表、肌肉、口腕、触腕及内脏团大面积溃烂,其死亡率高达90%;组织病理学显示:患病金乌贼的皮肤色素细胞崩解、肌肉肌丝断裂、鳃丝结构崩解、肝脏大量细胞坏死脱落、肠道上皮细胞微绒毛脱落和消失。超微病理学研究结果显示,患病金乌贼的肝脏、肠道、鳃丝出现了细胞核肿胀、细胞异常、部分细胞结构溶解消失等不同程度的病变。自患病金乌贼幼体内分离出3株优势菌(SE-A、SE-B和SE-C),人工感染实验证实,SE-A无致病性,SE-B、SE-C为该病的致病菌株。利用细菌形态观察、生理生化和分子生物学方法(16S rDNA)鉴定SE-B为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),SE-C为塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。根据该病的病症和病原特点,将该疾病命名为“乌贼弧菌性坏死病”。2、病原菌的来源分析及其相关毒力基因的检测通过对患病金乌贼幼体、育苗系统用水和生物饵料—糠虾进行细菌的来源、分布、优势度和菌株对比以期解析病原传播途径。细菌培养结果显示糠虾中携带大量细菌且从该样品中共分离到3株优势菌(KX-A、KX-B和KX-C),自育苗池进水口水样和育苗池水样分别分离到1株优势菌(W1-A和W2-A)。根据相关优势菌的形态、生理生化、16S rDNA鉴定结果可知KX-A为罗尼氏弧菌(Vibrio shilonii),KX-B、W1-A和W2-A为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus),KX-C为塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)。同时结合育苗管理技术工艺并对比育苗系统中各位点、各环节中细菌和弧菌数量以及优势菌株鉴定结果,证明“乌贼弧菌性坏死病”的2株病原菌的传播途径是由糠虾携带进入育苗系统。对2株病原菌—溶藻弧菌和塔氏弧菌的毒力基因检测结果表明,溶藻弧菌可能携带的11种毒力基因中检测出与溶血毒素相关的基因tlh和tdh以及与毒力贡献相关的基因ompW、FlaA和Collagenase。塔氏弧菌中检测出与溶血素毒力基因相关的vthA,相关检测结果将为解析病原致病机理提供基础数据。3、抗菌药物对病原菌的体外抑制作用研究以“乌贼弧菌性坏死病”的2株病原菌为研究对象,开展了抗菌药物和中草药的筛选。药敏试验结果显示,溶藻弧菌对强力霉素和氟苯尼考等药物敏感,对青霉素、链霉素、庆大霉素等药物具有耐药性;塔氏弧菌对氟苯尼考和罗美沙星等敏感,对新霉素、链霉素、克拉霉素等具有耐药性。体外抑菌实验显示,氟苯尼考的抑菌效果最好,对溶藻弧菌和塔氏弧菌的最小抑菌浓度分别为1.56μg/mL和3.13μg/mL,最小杀菌浓度分别为3.13μg/mL和6.25μg/mL。利用管碟法和二倍稀释法测定了15味单方中草药对金乌贼幼体弧菌性坏死病病原菌的体外抑菌实验显示,乌梅、五倍子、黄连和大黄4种中草药对2株病原菌的抑菌效果最好;将4种优选中草药按不同比例组成16种复方中草药进行体外抑菌实验,结果显示复方中草药的抑菌效果明显优于单方中草药,平均抑菌圈直径最大为23.79 mm,最小抑菌浓度降低到1.17 mg/mL。通过体外抑菌实验筛选出2种中草药复方,乌梅:黄连:大黄:五倍子以4:1:4:6比例混合可作为2株病原菌抑菌药物的首选复方组合,对2株病原菌的最小抑菌浓度为0.59 mg/mL;乌梅:黄连:大黄:五倍子以3:3:2:2比例混合可作为2株病原菌杀菌药物的首选复方组合,对2株病原菌的最小杀菌浓度为0.63 mg/mL。本研究首次报道了金乌贼幼体弧菌性坏死病的病原病理学,病原菌的来源分析及抗生素和中草药的筛选,为我国金乌贼的疾病防控、增养殖产业健康发展提供基础数据和理论参考。同时,筛选出针对该病病原的专用低毒、高效中草药配方,为开发相应的中草药制剂,保障食品绿色安全奠定了基础。
【图文】：

条纹,金乌贼,外观图,胴体

2图 1-1 金乌贼外观图Fig.1-1Appearance of Sepia esculenta征胴部呈盾形，胴体长大约为胴宽的 2 倍；雄性个体胴体背面的相的粗，且雄性背面条纹斑中夹杂有细小的斑点，雌性个体背清晰，有的靠近身体两侧，还有的只有密集的细小斑点。其胴楚，，生活状态时，体色金黄。胴体周围的肉鳍狭窄，在其末端不可见白色线条与若干个肉质突起[1-2,6]。腕的排列顺序与个体差别差异而不同[7]，内壳形状椭圆形，后端有一粗壮的骨针[8]。

脱水流程,组织病理

(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中选取与待分类菌株序列相似或相近的菌株，采用 ClustalX2.1 (http://www.clustal.org/download/current/)软件进行多序列匹配分析后，用 MEGA 6 (www.megasoftware.net)软件采用邻接法构建病原菌的系统发育树。2.4 组织切片的制备与观察2.4.1 石蜡组织切片的制备与观察将在 DavidsonísAFA 固定液中浸泡 24h 的组织块(0.5 0.5cm3)，转移到 70%乙醇溶液中再次浸泡 24 h 后进行组织病理切片制作，制作组织病理切片过程如下：(1) 酒精梯度脱水、二甲苯透明和浸蜡，具体流程如下图 2-1 所示：
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S947.9

【参考文献】