亚硝酸盐急性暴露激活草鱼肝和肾IRE1通路及诱导细胞凋亡的研究

发布时间：2020-05-27 02:17

【摘要】：随着高密度集约化养殖模式的不断发展,大量的含氮有机物沉积水体中,导致水体中亚硝酸盐浓度不断升高。高浓度亚硝酸盐暴露会引起鱼类产生氧化应激,造成未折叠、错折叠、突变蛋白积累,破坏内质网稳态并引起内质网应激,导致鱼类的大量死亡。为了应对这种环境应激,机体内质网会做出未折叠蛋白反应的保护性或适应性策略,以恢复内质网的稳态,如果内质网应激持续,细胞会开始出现凋亡。本研究分别从内质网应激和细胞凋亡的角度,探究了亚硝酸钠对草鱼肝脏组织、肝细胞和肾细胞的毒性损伤,以期为草鱼的科学化养殖提供可靠的科学理论依据。亚硝酸钠急性暴露草鱼实验中,分别用0 mg/L、8 mg/L、13 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠的溶液暴露草鱼,暴露时间为0 h,12 h,24 h,48 h和96 h,每个实验组设3个重复。实验结束后,采集草鱼的肝脏组织,进行细胞凋亡和内质网应激IRE1通路相关基因相对表达量、生化指标和抗氧化酶活性检测,采集草鱼鳃组织和肝脏组织检测组织学变化。亚硝酸钠急性暴露草鱼肝细胞实验中,分别用0 mg/L、5 mg/L、20 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠溶液暴露草鱼肝细胞(L8824),在暴露后12 h和24 h后,检测细胞活力、细胞凋亡和内质网应激IRE1通路相关基因相对表达量、细胞凋亡率以及细胞内游离钙离子变化。加入内质网应激通路IRE1α核酸内切酶的抑制剂,进行细胞活力、内质网应激IRE1通路和细胞凋亡相关基因相对表达量、细胞凋亡率以及细胞质内游离钙离子变化的检测。亚硝酸钠急性暴露草鱼肾细胞(CIK)实验中,分别用0 mg/L、25 mg/L和50 mg/L的亚硝酸钠溶液处理草鱼肾细胞12 h和24 h后,检测细胞活性、内质网应激和细胞凋亡相关基因相对表达量、细胞凋亡率。实验结果如下:1.对照组草鱼的鳃组织中,鳃片及鳃丝排列紧密有序,结构完整。草鱼暴露在50 mg/L亚硝酸盐96 h后,鳃小片出现基底上皮的增厚黏液细胞分泌增多,鳃小叶黏连,黏液细胞大量浸润鳃小叶之间,鳃小叶增生扭曲。对照组草鱼的肝脏组织中,肝细胞总体形态规律,细胞核位置明显,但在50 mg/L的亚硝酸盐暴露96 h后,出现了明显脂肪空泡化现象,组织充血,肝细胞水肿,细胞质溶解。肝糖原的含量在亚硝酸钠暴露高浓度组发生显著性的降低,碱性磷酸酶在亚硝酸钠暴露12 h和24 h发生了显著性的上升,而在亚硝酸钠暴露48 h和96 h后发生了显著性的下降,在亚硝酸钠暴露12 h后SOD的活性显著升高,而在随着暴露毒时间的延长,SOD的活性与对照相比显著下降。grp78、ire1α和xbp1s mRNA在亚硝酸钠暴露后表达量与对照相比明显上升,其中grp78 mRNA表达量在亚硝酸盐暴露96 h后达到最大值,而ire1α和xbp1s表达量在暴露12 h后达到最大值。2.亚硝酸钠急性暴露草鱼肝细胞实验中,亚硝酸钠处理组的细胞凋亡率显著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表达量显著升高,bcl-2 mRNA的表达量显著下降,细胞内钙离子浓度显著上升。与亚硝酸钠单处理组相比,加入IRE1α核酸内切酶抑制剂(STF-083010)处理组的细胞凋亡率显著下降,ire1α、xbp1s、grp78、jnk、bax、caspase3 mRNA表达量显著下降,bcl-2 mRNA表达量显著上升,加入IP3R通道的抑制剂(2-APB)或STF-083010处理组的细胞内钙离子浓度均显著下降。3.亚硝酸钠急性暴露草鱼肾细胞实验中,细胞活性显著降低,AO染色结果显示亚硝酸钠处理组细胞核和细胞质内荧光强度增强,细胞凋亡率显著上升,jnk、bax、caspase9、caspase3、ire1α、xbp1s和grp78 mRNA表达量在高浓度亚硝酸钠暴露后显著升高。ire1α、xbp1s、grp78 mRNA表达量在低浓度亚硝酸钠暴露时显著升高,随着时间的延长,表达量显著下降。综上所述,亚硝酸盐急性暴露导致草鱼应激,造成肝脏组织和鳃组织损伤,肝脏生化指标和抗氧化酶活性发生显著性变化,肝脏组织、肝细胞和肾细胞内质网应激IRE1通路和细胞凋亡相关基因的表达显著升高,肝细胞和肾细胞活性显著降低,凋亡率显著升高,肝细胞内钙离子浓度显著上升。在亚硝酸钠暴露引起的草鱼肝细胞凋亡中,内质网应激IRE1通路发挥一定作用。
【图文】：

途径,转录因子,蛋白质,蛋白酶体

PR的目的是减轻ERS，恢复ER稳态，并防止细胞死亡。为了维一些协调的反应，包括：1）增加了新蛋白质的进入，从而防折叠和超载；2）ER的折叠能力处理错误折叠的蛋白质；3）排出，随后降解蛋白酶体中的蛋白质；4）如果上述步骤不能因为这些反应至少依赖于一部分非转录因子，所以信号必须从关mRNA和蛋白质的表达。ERS被激活后机体做出的一种自身保护机制，涉及多种细胞线粒体、核糖体、高尔基体以及细胞核等多种细胞器之间的报道在酵母中出现，并发现了IRE1（inositol-requiring enzym在真核高等生物中发现了另外两条通路，分别为PERK（PRK）和活化转录因子6（activating transcription factor-6, ATF6示（图1）。

途径,神经母细胞瘤,人类基因组,应激反应

2+等，它们具体的途径如下（图2）。图2 内质网应激反应诱导的细胞凋亡途径（Rasheva and Domiagos 2009）Fig. 2 Apoptosis pathway induced by endoplasmic reticulum stress reaction1.4.1 Caspase12途径有研究表明，Caspase12在人类基因组中并不存在，原因可能是在进化时丢失了这个基因（Han et al 2009; Fischer et al 2002）。有报道，人体中Caspase4（cysteinylaspartate specific proteinase 4, Caspase4）与Caspase12的同源性最高。在HeLa细胞和神经母细胞瘤中，Caspase4可以代替Caspase12来行使功能（Egger et al 2003）。Caspase12在机体内主要存在的场所是ER，机体发生应激反应后可以通过Caspase12引发凋亡反应，并只能通过ERS的途径来诱导细胞凋亡（Nakagawa et al2000）。在机体正常状态下，Caspase12的存在形式是无活性的
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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