团头鲂补体替代途径相关基因的鉴定及表达研究

发布时间：2020-05-27 11:18

【摘要】：团头鲂(Megalobrama amblycephala)是我国重要的大宗淡水养殖鱼类之一,但是近年来由于嗜水气单胞菌引起的细菌性败血症较为严重,造成巨大的经济损失。鱼类获得性免疫系统不够发达,先天性免疫系统在抵御病原体入侵中发挥着不可替代的作用。补体系统是先天性免疫的重要组成部分,补体替代途径包括补体因子D(complement factor D)、补体因子P(complement factor P)、补体因子I(complement factor I)和补体因子H(complement factor H),被称为最古老的补体激活途径,对补体系统的激活有着重要作用。对补体替代途径相关分子的研究,有助于我们了解团头鲂先天性免疫防御机制,对团头鲂病害防控和遗传育种方面具有重要意义。本研究克隆了团头鲂Pf(MamPf)、If(MamIf)和Hf(MamHf)基因的ORF序列,并对其进行了生物信息学分析。利用荧光定量PCR技术对这些基因在健康组织和感染嗜水气单胞菌后免疫组织的表达进行了分析。原核表达MamDf重组蛋白,检测MamDf重组蛋白的抑菌活性。利用Western blot技术检测了团头鲂肝脏、脾脏、肾脏和头肾中MamDf蛋白在感染嗜水气单胞菌后的表达变化。本研究主要结果如下:1.团头鲂3个补体基因(MamPf、MamIf和MamHf)的序列分析MamPf ORF全长1329 bp,编码442个氨基酸,DNAstar预测其分子量为48.9kDa。NetNGlyc 1.0 Server预测显示其没有N-糖基化位点。多序列比对分析显示,团头鲂和其他物种的Pf都是由6个TSR结构域组成,而且TSR结构域中有相应的保守序列。系统进化分析显示,鱼类Pf聚为一支,哺乳动物聚为另一支,团头鲂与斑马鱼的Pf在进化上亲缘关系最近。基因结构分析显示,团头鲂Pf基因含有9个外显子和8个内含子,不同物种间外显子和内含子的数量相似。MamIf ORF全长2007 bp,编码668个氨基酸,其分子量为74.6kDa,具有6个N-糖基化位点。团头鲂和其他物种的If都是由1个FIMAC结构域、1个SRCR结构域、2个LDLa结构域和一个丝氨酸蛋白酶胰蛋白酶超家族结构域组成,而且不同物种中每个结构域中都有相应的保守序列。团头鲂与鲤的If在进化上亲缘关系最近,鱼类If聚为一支,哺乳动物单独聚为另一支。MamHfORF全长2589 bp,编码862个氨基酸,其分子量为97.5kDa,具有2个N-糖基化位点。团头鲂Hf基因含有13个重复的SCRs结构域,不同物种具有的SCR结构域的数量不同。团头鲂与斑马鱼的Hf在进化上亲缘关系最近,鱼类Hf聚为一支,哺乳动物单独聚为另一支。2.团头鲂3个补体基因(MamPf、MamIf和MamHf)在健康组织和感染嗜水气单胞菌后免疫相关组织中的表达MamPf、MamIf和MamHf基因在健康团头鲂10种组织中均有表达。MamPf基因在肾脏中表达量最高,在肠中表达量最低,在其他组织中均有表达;MamIf基因在肝脏中表达量最高,在肾脏、血液、鳃和心脏中表达量高,在脑中表达量最低;MamHf基因在肝脏中表达量最高,在肌肉中表达量最低,在其他组织中均有表达。感染嗜水气单胞菌后,各组织中MamPf、MamIf和MamHf基因mRNA发生了显著性的变化,但不尽相同。在肝脏中,MamPf在感染后24 h显著上调并达到峰值,5 d时恢复到对照组水平;MamIf在感染后4 h有显著性上调,5 d时显著上调并达到峰值;MamHf在4 h～5 d均显著上调,3 d时达到最大值。在脾脏中,MamPf在感染后4 h,表达量显著下调,24 h显著上调并达到峰值;MamIf在4h显著上调并达到峰值,而后降低到对照组水平;MamHf在4h显著上调并达到最大值,24h降低到对照组水平。在肾脏中,MamPf表达量在感染后4h～5d均显著上调,4h达到峰值;MamIf表达量在4h显著上调并达到峰值,24 h显著下调,3d降低到对照组水平;MamHf在4h和24h都显著上调,并且在4h达到最大值。在头肾中,MamPf表达量在4h~3d均显著上调,并且在4h达到最大值,5d降低到对照组水平;MamIf在4h显著上调并达到最大值后显著下调,后在5d时达到对照组水平;MamHf在4 h和24 h都显著上调,并且在4 h达到最大值,3 d后回到对照组水平。3.团头鲂补体因子D(MamDf)重组蛋白抑菌活性及Western blot分析MamDf基因有5个外显子和4个内含子。成功构建了pET28a-Df原核表达载体,并且筛选了最佳表达条件(37℃、180 r/min、IPTG=0.05mmol/L诱导6 h)。MamDf重组蛋白对嗜水气单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长有明显的抑制效果,而且,重组蛋白对革兰氏阴性菌的抑制效果要强于格兰氏阳性菌。采用Western blot方法分析了团头鲂感染嗜水气单胞菌后免疫组织的蛋白表达情况,结果显示,在嗜水气单胞菌刺激后4 h-5 d内,MamDf在肝脏、脾脏、肾脏和头肾中都有明显的上调。
【图文】：

补体系统,激活途径,转化酶

三种途径的激活导致经典/凝集素途径 C3 转化酶（C4b2b）和替代途径 C3 转化酶（C3bBb）的产生（Holers 2014）。C3 被切割后产生 C3a 和 C3b 这两个主要的片段，C3a 是一种有效的炎症介质，C3b 是一种调理素，它沉积在靶细胞和颗粒的表面，促进吞噬作用。C3b 还可以正反馈形成更多的 C3 转化酶，扩大补体级联反应。此外，C3b 与已经存在的 C3 转化酶结合后，形成复合物 C5 转化酶，C5 转化酶有切割 C5 的能力，以此激活补体终末途径，最后形成膜攻击复合物来导致靶细胞裂解和炎症反应（Merle et al 2015）。尽管这些活化过程对病原微生物的清除是有利的，但它们对宿主细胞具有潜在的破坏性。为了防止宿主组织的损伤，补体系统的激活受膜结合蛋白和血浆调节分子的严格调节（Chuang et al2010）。而且替代途径还可以作为经典途径和凝集素途径的扩大环路，据研究表明，，即使补体级联反应由经典途径和凝集素途径启动，替代途径产生的活性物质也可占补体激活产物的80%，因此替代途径的调节尤其重要（Harboe et al 2008）。

团头鲂,总RNA提取,琼脂糖凝胶电泳

VA）和 T 检验，并用 Duncan 进行多重比较，数值均采用平均值±标an±SE）表示，当 P<0.05 时，认为差异显著；当 P<0.01 时，认为差。果与分析总 RNA 提取结果结果如图 2-1 所示，所提取的团头鲂总 RNA 有三条带，从大到小依次为和 5S，从图中可以看出 28S 和 18S 的亮度比大约是 2:1 且条带明亮，较弱，表明提取的总 RNA 具有较好的完整性。经超微量紫外分光光度 OD260/OD280的值也都在 2.0 左右，表明总 RNA 的纯度较高，可用于后
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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