杂色鲍HSP90、HSC70和HSP70基因启动子基本功能的初步研究

发布时间：2020-05-28 04:42

【摘要】：热休克蛋白(Heat shock proteins,HSPs)是细胞在高温及其他应激条件下产生的一类高度保守的蛋白质,HSPs作为一类重要的分子伴侣,从原核细胞到真核细胞都有表达,在蛋白质折叠、转运、复性、降解中起重要作用。HSP90和HSP70是HSP家族最重要的成员,在各种应激反应中发挥着重要的作用,都具有抗细胞凋亡、细胞免疫等功能。启动子是位于基因5’端的DNA序列,能被RNA聚合酶识别并结合,启动子作为调控基因表达的重要顺式元件,决定着基因的活动,因此启动子也日益成为研究的热点。本研究是在课题组已有的杂色鲍HdHSP90的cDNA基因全长及NCBI已公布的杂色鲍HdHSP70和HdHSC70基因cDNA序列的基础上,通过Genome walker、Tail-PCR以及常规PCR等技术克隆获得了这三个基因的5’调控区序列。并结合重组质粒的构建、细胞培养、瞬时转染和双荧光素酶报告基因检测等方法,在转录调控水平揭示杂色鲍HdHSP90、HdHSP70和HdHSC70基因转录调控机制。主要研究结果如下:1)通过Genome walker和Tail-PCR技术,利用已知的序列分别新扩增得到5’调控区:杂色鲍HdHSP90基因2800 bp、HdHSC70基因2013 bp、HdHSP70基因2140 bp。2)生物信息学分析表明,这三个HSPs基因在转录起始位点(A)上游-30—-32 bp之间都存在一个TATA box,且在不同的位置都有一个CpG岛,三者有很多共同的转录因子结合位点,如:ATF、NF-1、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalp等,并都有多个热休克元件(HSE)。3)通过验证确定杂色鲍HdHSP90基因的核心启动子区位于-98 bp—+83 bp之间,HdHSC70基因核心启动子区位于-104 bp—+43 bp之间,HdHSP70基因的核心启动子区位于-189 bp—+46 bp之间。4)成功构建了杂色鲍HSP90基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒,活性分析表明:7个缺失片段的启动子活性都比较高,其中pGL-90-6r活性最高。通过转录因子结合位点的突变分析得知在-624 bp—-539 bp间的Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这三个转录因子都起到一定的抑制作用。5)成功构建了杂色鲍HSC70基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒,活性分析表明:不同长度缺失片段的HdHSC70基因启动子活性除了pGL-c70-7r出现明显的降低,且比pGL-c70-6r的活性有极显著降低(P0.01)外,其余活性都很高。通过突变分析最短的两个缺失片段之间的转录因子结合位点,结果发现杂色鲍HSC70基因靠近-252 bp这一位置的ICSBP对杂色鲍HSC70基因的表达有一定的增强作用。6)成功构建了杂色鲍HdHSP70基因7个不同长度缺失片段的启动子质粒,启动子活性分析表明,HdHSP70基因启动子活性也比较高,其中pGL-70-2r活性最高,显著高于pGL-70-1r和pGL-70-3r的活性(P0.05)。本实验还发现,所有构建的HdHSP70基因缺失片段的启动子的相对荧光活性普遍低于HdHSC70基因。
【图文】：

SP90、HSC70 和 HSP70 基因启动子基本功能的初步研究5图1.1 热激蛋白的转录激活调控模式图1.3 启动子的研究基因的表达调控一直是人们研究的热点之一，启动子作为调控基因表达调控的重要顺式元件，决定着基因的活动，因此启动子也日益成为研究的热点[58]。启动子作为真核生物基因的重要组成部分，通常位于基因的5’ 端上游区的，RNA 聚合酶能够识别并与之结合，启动子区有转录因子特异结合的位点，不同的转录因子对转录有正或负的调节作用，根据这一特点，，可以使某些基因特异性表达或抑制，控制特定基因在细胞内的表达水平。从而调节机体一系列生理活动。根据启动子在转录中调控能力的不同

集美大学硕士学位论文 杂色鲍 HSP90、HSC70 和 HSP70 基因启动子基本功能的初步第 2 章 材料与方法2.1 材料2.1.1 实验动物杂色鲍购自福建省厦门市大嶝岛。2.1.2 实验所用菌株、质粒载体感受态细胞 DH5α 是本实验室用原先保存的菌株所制备。克隆所用质粒载体 pMD购自 TaKaRa 公司。pGL3- Basic 质粒 (含萤火虫荧光素酶报告基因) 及 pRL-TK 内参(含海肾萤光素酶报告基因)购自 Promega 公司，实验所用的人胚胎肾 293FT 细胞株、pEGFP-N1 由厦门大学医学院眼科研究所馈赠。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：2684726