EGCG在草鱼体内的代谢及其对致病菌抑菌功效

发布时间：2020-05-29 00:49

【摘要】：表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体,是茶多酚生物活性的主要成份。本实验以草鱼为实验对象,探索以浓度为75mg/kg的EGCG灌胃草鱼后,在不同时间点分析鱼血浆及组织样品中儿茶素的代谢规律。此外,我们还比较了四种儿茶素:表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素(EC)体外抑制草鱼致病菌嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌和柠檬酸杆菌的功效研究。结论如下:(1)建立了草鱼血浆和组织样品的前处理方法。分别准确吸取0.6mL血浆、2m L肝匀浆液于10mL具塞离心管中,均加入为40μL的20%的Vc以及200μL的0.05%Na2-EDTA溶液,混匀后,再准确加入乙酸乙酯4m L,振荡5min,6000r/min高速离心5min,取出全部上层有机相;再加入2mL乙酸乙酯重复萃取一次,合并两次萃取的有机相于尖底玻璃离心管中,45℃水浴中弱氮气流吹干,向血浆样品中加入500uL10%的乙腈-水溶液,振荡溶解,18000r/min高速离心5min后,吸取上清液20μL进样分析。肝脏组织萃取液挥干后用500uL的10%乙腈-水溶解,然后再加入0.5mL正己烷去脂,振荡后,18000r/min高速离心5min后,弃去全部正己烷层,0.5mL正己烷重复去脂一次,高速离心后取下层20μL进样分析。(2)运用HPLC检测分析血液、肝脏中的EGCG的含量,根据标准曲线进行含量测定,作出EGCG在血清、肝脏中吸收代谢的浓度-时间曲线图。灌胃之后,分别于15min、30min、45min、60min、120min和300min六个时间点收集鱼血液样品。经与EGCG标品、空白样品对照,灌胃后15-300min血清中均能检测到EGCG原型,且15-45min时间范围内,随着时间推移,血浆中EGCG的浓度不断上升,45min时达到最大浓度。达峰时间Tmax为45min,最大浓度Cmax为512.8068ug/mL,在此浓度下,计算得到的相对生物利用度为5.57%,60-300min随之缓慢下降。(3)同样,15-300min时间范围内的肝脏样品中也均能检测到EGCG原型,在15-60min时间范围内,随着时间推移,EGCG浓度不断增加,灌胃后60minEGCG达到最大浓度Cmax434.1476ug/mL,达峰时间Tmax为60min。(4)运用UPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS对样品组织进行分析检测,结果表明,15-300min时间范围内在血清、肝脏和肠道组织样品中均能检测到EGCG原型,在时间点为30min的肝脏样品中检测到ECG的存在,60-300min时间范围在血清、肝脏和肠道组织样品中均检测到EGCG代谢产物ECG的存在。(5)通过一系列递增浓度的儿茶素溶液对四种菌液的抑菌试验研究可知,四种儿茶素对四种菌大肠杆菌44102、柠檬酸杆菌、铜绿假单胞菌和嗜水气单胞菌均有不同程度的抑菌效果,低浓度的药液(0.05-0.4mM)的抑制作用属于低敏;中浓度的药液(0.4-2.0mM)的抑制作用属于中敏;高浓度的药液(2.0-10mM)的抑制作用属于高敏。0.05mM为MIC(最低抑菌浓度),当药液浓度由0.2mM增加到4.0mM时,抑菌圈的增幅较大,抑菌效果增强的幅度较为明显;当药液浓度由4.0mM增加到10.0mM时,抑菌圈增幅较小,抑菌效果增强的幅度较小,抑菌效果逐渐达到上限。总体来看,随着药液浓度的增加,抑菌圈直径呈增长趋势,即抑菌强度随药液浓度增加而增加。同一浓度的药液对不同菌的抑制作用不同。EGCG对三种强致病菌嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌和铜绿假单胞菌抑菌效果强于非致病菌大肠杆菌44102,其中,柠檬酸杆菌被抑菌效果最强。并且,EGCG的抑菌效果强于其余三种儿茶素,EGCGEGCECGEC。
【图文】：

技术路线图,草鱼,体外抑菌,儿茶素

2.2 主要研究内容（1）建立了鱼血浆和组织样品中 EGCG 的前处理方法。（2）运用 HPLC 检测分析不同时间点血液、肝脏中的 EGCG 的吸收及代谢规律制浓度-时间曲线。（3）UPLC-ESI-Orbitrap-MS/MS 确定血清、肝脏、肠道组织中 EGCG 的代谢产（4）比较四种儿茶素 EGCG、EGC、ECG、EC 对草鱼致病菌嗜水气单胞菌、铜单胞菌和柠檬酸杆菌抑菌功效的研究。（5）草鱼肠道内容物体外抑菌效果的研究。2.3 技术路线（图 2-1）

前处理方法,血清

6000r/min离心10min，提取上清液。合并两次上清液，氮气吹干。加入500μL10%乙腈-水复溶，然后过0.22μm有机相滤膜进液相。两种方法处理的血清样品进样后的HPLC分析图如图3-1所示。图 3-1 血清前处理方法的比较Fig.3-1 The comparison of plasam pretreatment method通过图3-1比较分析可知，方法二出峰效果较好，故方法二比方法一萃取所得目标成分的效果好。方法二液液萃取用的有机试剂是乙酸乙酯，方法一用的是甲醇。方法二中，我们加入了抗氧化成分抗坏血酸及金属螯合剂Na2-EDTA从而起到了保护目标物的作用，且要加大原液量，方法一中我们选用的200μL血清样品，在二中我们增加到600μL，并且增加复溶次数，，这都更加有利于我们对目标成分的检测。（3）HPLC梯度洗脱条件的探究和改进HPLC洗脱条件一：A相为0.2%甲酸水，B相乙腈
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S948

【引证文献】