基于多组学技术研究长江刀鲚感染线虫后的免疫适应机制

发布时间：2020-05-29 06:27

【摘要】：长江刀鲚是长江下游流域最为重要的捕捞和消费对象,是目前长江流域唯一能形成稳定渔汛的江海洄游型鱼类。在水域生态环境恶化及人类捕捞胁迫的双重影响下,长江刀鲚资源日趋枯竭,目前年捕捞量仅约为历史最高纪录的2%。本研究系统调查长江刀鲚线虫感染特征及寄生线虫群落特征;基于简化基因组技术和耳石指纹元素技术筛选出遗传背景相似、洄游履历相近的长江刀鲚实验样本,综合利用转录组和代谢组技术研究长江刀鲚感染异尖线虫后相关免疫基因及代谢产物的变化,揭示与感染异尖线虫相关的免疫信号通路,探讨洄游群体感染异尖线虫后所产生的免疫适应性反应。结合长江刀鲚种群生态学研究,进一步探讨长江刀鲚与寄生异尖线虫间的相互作用机制,研究结果对于后续异尖线虫感染对长江刀鲚种群补充的影响研究具有积极意义。本文主要研究内容如下:系统调查了长江刀鲚感染线虫情况。渔汛期内在长江口至鄱阳湖的7个调查断面上共采集长江刀鲚695尾,从541尾样本中检出线虫7271条,总体感染率为77.84%,平均感染强度为13.44±30.68条/尾,平均感染丰度为10.46±27.63条/尾,不同断面间刀鲚样本线虫感染强度和感染丰度差异显著(p0.05)。利用分子鉴定方法对随机抽样的1160条线虫的鉴定结果显示,共检出异尖科线虫2属6种,分别为派氏异尖线虫(Anisakis pegreffii)、简单异尖线虫(A.simplex)、内弯宫脂线虫(Hysterothylacium aduncum)、费氏宫脂线虫(H.fabri)、中华宫脂线虫(H.sinens)和厦门宫脂线虫(H.amoyense),其中派氏异尖线虫为优势种,占84.84%。ITS序列分析结果显示,派氏异尖线虫的单倍型多样性(Hd)为0.174,核苷酸多样性(π)为0.00028,各断面群体间没有发生明显的遗传分化(Fst0.05),总基因流(Nm)为75.74,群体间基因交流充分。研究了长江刀鲚抽样群体遗传背景。利用2b-RAD技术对165尾长江刀鲚样本进行测序,经筛选和聚类分析后,获得373244个标签,其平均Unique标签数为289602个,Unique标签比对率变幅为73.77%-80.25%。利用SOAP软件将过滤后的Enzyme Reads比对到参考序列,以最大似然法(ML)进行SNP标记分型,共获得SNP标记36975个,其中高度多态性的SNP(PIC0.5)位点共计26个。群体二态性SNP标记36469个,其中以A/G和C/T转换的形式为主,分别有10013个和12881个,分别占SNP总量的27.08%和34.84%;转换与颠换比为1.69。分组间平均观测杂合度Ho变化范围为0.1286-0.1408,平均期望杂合度He最小为0.1340,最大为0.1446,各分组间遗传分化系数均低于0.005。表明长江刀鲚洄游群体遗传分化程度极低,个体信息交流紧密,杂合度较高,具有丰富的遗传多样性。通过本次筛选验证可保证长江刀鲚组学实验样本具有相似的遗传背景,进而排除实验样本种质差异对分析结果的干扰。研究了长江刀鲚抽样群体生境履历。利用耳石指纹元素技术对81尾长江刀鲚样本的生境履历进行反演,共发现3种生态类型:江-海洄游型(91.36%)、江-河口洄游型(6.17%)和淡水定居型(2.47%)。就感染线虫与生境履历的关系而言,所有感染线虫的长江刀鲚样本均具有江海洄游履历,但具有江海洄游履历的长江刀鲚不一定感染线虫,淡水定居型均未感染线虫。本次筛选验证可保证长江刀鲚组学样本具有相近的洄游履历,进而排除实验样本因栖息生境的差异对分析结果产生干扰。进行了长江刀鲚肝脏转录组分析。利用RNA-seq技术对感染异尖线虫后的长江刀鲚肝脏组织进行表达谱分析。测序完成后,对原始数据进行过滤、组装后共获得62604条Unigene。通过GO和KEGG等生物信息学方法对Unigene进行注释和分析,并预测其功能。对基因表达差异分析,共获得961个差异表达基因,包括545个上调基因和416个下调基因。10个宿主基因qRT-PCR检测结果与RNA-seq结果一致,进一步证明RNA测序结果的真实性和可靠性。通过pathway富集分析,筛选出免疫相关基因和免疫信号通路,包括参与抗原加工和呈递过程的MHCⅡ、TCR、CTSL以及CIITA基因和参与T细胞受体信号通路的TCR、CD3D、LCP2、ITK、IL10以及p38基因。本研究为进一步了解异尖线虫和长江刀鲚之间的相互作用机制提供了数据支撑。进行了长江刀鲚血清代谢组分析。利用GC/MS技术对感染异尖线虫后的长江刀鲚血清进行非靶向代谢组学分析,共检测出65种差异代谢物,其中28种代谢物上调,37种代谢物下调。多元统计分析(PLS-DA和OPLS-DA)表明,异尖线虫感染对刀鲚血清代谢谱产生了显著(p0.05)影响。对异尖线虫感染后的长江刀鲚血清中代谢物及其参与的代谢通路进行了分析,发现甘油酯代谢、生物素代谢、戊糖磷酸循环、丙氨酸代谢、d-谷氨酰胺和d-谷氨酸代谢、嘧啶代谢和三羧酸循环通路中有很多代谢物及调控相关代谢物合成的基因都出现了表达量变化。此外,还发现DAG的表达量显著上调,并在T细胞激活所需的关键免疫通路中发挥重要作用。
【图文】：

示意图,刀鲚,采样断面,长江

图 2-1 长江刀鲚采样断面示意图Figure 2-1 Sketch for sampling sites of C. nasus.2 主要仪器与试剂主要仪器设备：Leica M165C 解剖镜；PCR 仪；电泳仪；BOX F3 凝胶成像

线虫感染,宿主

图 2-2 不同数量线虫感染宿主的比例Percentage of host infected the different number of nem鲚线虫感染情况1~9 10~19 20~29 30~39 >40寄生线虫数量
【学位授予单位】：安徽师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

【参考文献】