黄颡鱼PI3Ks功能解析及其通路在胰岛素调控脂类代谢中的作用机制

发布时间：2020-05-31 17:07

【摘要】：磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)信号通路在增殖、凋亡、存活以及代谢等细胞生物学进程中发挥着重要的作用。目前,有关PI3K家族基因的结构和功能在哺乳动物中已取得了一定的进展,但是却很少有对鱼类的PI3K家族基因进行研究。胰岛素介导的PI3K信号通路(胰岛素受体底物/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B,IRS-PI3K-AKT)是胰岛素信号通路中的经典通路。在哺乳动物中,已有大量研究表明该信号通路调控机体的营养代谢活动,促使机体糖原、脂肪和蛋白质的合成。目前在鱼类中,有关胰岛素对脂代谢研究相对缺乏,并且很少有学者关注IRS-PI3K-AKT信号通路在鱼类脂肪代谢中作用。本论文以黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)为研究对象,研究黄颡鱼PI3K家族基因的结构和功能,并结合IRS-PI3K-AKT信号通路探讨胰岛素调控黄颡鱼肝脏脂代谢的作用机制。具体包括以下几个方面:1、黄颡鱼pi3ks家族基因的分子克隆及组织表达分析为了初步了解黄颡鱼pi3ks家族基因基本特征,本研究采用RACE技术从黄颡鱼中共克隆得到7个不同亚型的pi3k,它们分别是pi3kca、pi3kcb、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2a、pi3kc2b和pi3kc3,全长c DNA序列分别为4585 bp、5881 bp、4036 bp、3786 bp、6350 bp、6030 bp和3552 bp,分别编码1069、1069、1044、1104、1670、1579和877个氨基酸。氨基酸结构域分析显示,7个pi3k亚型共分为I、II和III 3类,所有pi3k亚型均包括N端C2结构域、PIK结构域、催化结构域,并且所有保守结构域中,催化结构域相似度最高,而且都包含保守的ATP结合位点。进化分析显示7个黄颡鱼不同亚型pi3k明显的分成I、II、III 3类,在I类中又明显的分成4大枝,并且pi3kcb跟pi3kcd的亲缘关系更相近,并且在进化上黄颡鱼与墨西哥脂鲤在硬骨鱼类分枝上亲缘关系较近,而与哺乳动物亲缘关系较远。通过荧光实时定量PCR技术,研究了黄颡鱼不同亚型pi3k在不同组织中的基因表达水平。结果显示:不同亚型pi3k均在卵巢中表达量最高,pi3kca、pi3kcb、pi3kc2a、pi3kc2b以及pi3kc3广泛表达于不同组织。而pi3kcd和pi3kcg属于组织特异性表达,特别是在肝脏、肠道、肾脏、心脏以及鳃中表达量非常低。2、黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子克隆及其功能研究本实验以第一部分实验获得PI3K的c DNA序列为基础设计引物,利用hitail PCR方法进行pi3k启动子区域克隆,最后共得到pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的5’上游启动子序列长度分别为360 bp、1848 bp和367 bp。生物信息学分析显示pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3的核心启动子区结构不一样,其中pi3kca和pi3kc2b包含Cp G岛,但不存在CAAT和TATA盒。而pi3kc3包含CAAT和TATA盒,但不存在Cp G岛。同时,根据Mat Inspector和JASPAR数据库,我们还预测到pi3kca启动子区可能存在HNF1、STAT和NF-k B转录因子结合位点;pi3kc2b启动子区存在FOXO1、PPAR-RXR、STAT、IK1、HNF6和HNF3转录因子结合位点;pi3kc3启动子区存在FOXO1和STAT转录因子结合位点。为了进一步验证黄颡鱼pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3不同区域启动子的功能。我们通过构建pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子缺失序列表达载体,分别瞬时转染到Hep G2细胞,通过双荧光素酶活性测定,确定pi3kca、pi3kc2b和pi3kc3启动子的活性区域。结果显示:pi3kca的-360/-224 bp区域负调控启动子活性,而-224/+71 b区域正调控启动子活性;pi3kc2b的-1848/-1522 bp区域正调控启动子活性,-1522/-623 bp区域不影响启动子活性,-623/-388 bp负调控启动子活性,-388/-144 bp正调控启动子活性,-144/+79 bp区域正调控启动子活性;pi3kc3的-367/-291 bp区域不影响启动子活性,而-291/+59 bp区域正调控启动子活性。同时,我们还发现FOXO1抑制剂AS1842856孵育显著降低pi3kc2b和pi3kc3部分载体的启动子活性。进一步的定点突变分析和凝胶阻滞分析(electrophoretic mobility-shift assay,EMSA)证明HNF1和IK1转录因子分别能直接与pi3kca和pi3kc2b启动子结合,并负调控pi3kca和pi3kc2b启动子活性;而FOXO1转录因子能够直接与pi3kc2b和pi3kc3启动子结合,并正调控启动子活性。3、黄颡鱼不同组织pi3kca启动子甲基化特征的初步研究为了分析黄颡鱼不同组织中pi3kca的转录水平与其启动子的甲基化状态之间的关系。我们应用重亚硫酸盐修饰黄颡鱼不同组织的DNA,并通过BSP(bisulfite sequencing PCR)法测定黄颡鱼不同组织pi3kca启动子的甲基化水平,应用荧光定量PCR的方法检测黄颡鱼不同组织中pi3kca以及甲基转移酶(dnmts:dnmt1,dnmt3a,dnmt3b)的mRNA表达水平。结果共扩增得到pi3kca启动子和第一外显子Cp G岛附近536 bp序列,包含34个Cp G位点。通过统计分析,发现pi3kca甲基化位点主要发生在转录起始位点(+1)附近的-71,-64,-52和+8 Cp G位点,并且pi3kca启动子在黄颡鱼不同组织中均处于低甲基化水平。定量PCR分析显示,pi3kca在不同组织中的mRNA表达水平和甲基化水平无明显相关性,而3种dnmts均在卵巢中表达量最高,这很可能与pi3kca启动子甲基化水平也在卵巢中最高有关。4、胰岛素激活IRS-PI3K-AKT信号通路调控黄颡鱼肝脏脂代谢的机制研究为了研究胰岛素对黄颡鱼肝脏脂代谢的调控机制,本研究分别结合离体肝细胞实验和活体原位注射实验来进行。首先,通过分离原代黄颡鱼肝细胞,选取(0、10n M、100 n M、1000 n M)四个浓度的胰岛素进行孵育肝细胞,分别在48 h取样,测定的指标包括肝细胞存活率、不同亚型IRS-PI3K-AKT基因的表达、肝细胞甘油三酯(TG)的累积、脂代谢相关酶酶活与基因表达。结果显示:胰岛素有促进肝细胞TG合成的趋势,100 n M胰岛素处理显著增加肝细胞TG的合成。对于不同亚型的IRS-PI3K-AKT基因表达的影响,胰岛素不同程度增加了肝细胞irs1、irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2的mRNA表达水平,但不影响pi3kca、pi3kcd、pi3kcg、pi3kc2b、pi3kc3、akt3a和akt3b的mRNA表达水平。胰岛素显著促进肝细胞FAS、G6PD和6PGD酶活性的增加,但不影响CPT-I的活性。此外,胰岛素促进fas、g6pd、6pgd和pparγ等脂代谢合成基因的表达,而降低cpt 1a和pparα等脂代谢分解基因的表达。本研究表明,在黄颡鱼肝细胞中,对于不同亚型的IRS-PI3K-AKT蛋白,胰岛素很可能优先激活irs2、pi3kcb、pi3kc2a、akt1和akt2亚型。其次,胰岛素能够促进肝细胞TG的合成,但存在一定的浓度效应,其中100 n M胰岛素处理组最为显著。其次,为了进一步验证胰岛素是否能实际调控黄颡鱼肝脏脂代谢,比较离体与在体条件下胰岛素对黄颡鱼脂代谢影响的差异。我们通过黄颡鱼腹腔注射(0、0.01μg/g、0.1μg/g、1μg/g)四个胰岛素浓度,分别在48 h取样,分析黄颡鱼肝脏脂肪的沉积、肝脏脂肪代谢相关酶酶活和基因表达水平的影响。结果显示:随着胰岛素注射浓度增加,肝脏脂肪滴沉积增加,FAS酶活性也随着增加。胰岛素促进G6PD和6PGD酶活性的增加,但不影响CPT I的活性。对脂代谢基因表达的影响,胰岛素有增加fas和g6pd基因表达的趋势。0.01μg/g和0.1μg/g胰岛素处理组显著增加6pgd基因的表达。0.1μg/g胰岛素注射显著增加cpt 1a的表达。胰岛注射降低pparα的表达。0.01μg/g和0.1μg/g胰岛素处理组显著增加pparγ的表达。本研究表明,无论是活体注射和离体实验,胰岛素促进黄颡鱼肝脏脂肪滴的沉积,并且伴随着FAS、6PGD、G6PD和PPARγ脂肪合成相关酶酶活增加和基因表达的上调。而胰岛素对cpt 1a基因的表达的影响在离体和在体实验中呈现不同的趋势,表明胰岛素对CPT I的调控可能受多种因素的影响。5、PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素调控黄颡鱼脂代谢中的作用为了深入了解PI3K和FOXO1信号通路在胰岛素影响黄颡鱼脂代谢过程中的作用机制。我们探讨了离体条件下,PI3K特异性抑制剂(Wortmannin)和FOXO1特异性抑制剂(AS1842856)的添加对胰岛素诱导黄颡鱼肝细胞脂代谢的调控变化。胰岛素与Wortmannin共同孵育的结果显示:与对照组相比,单独的Wortmannin孵育降低肝细胞TG的沉积,但没有影响fas、g6pd、6pgd、pparα和pparγ相关基因的表达,并且降低cpt 1a基因的表达。与胰岛素处理组相比,Wortmannin提前孵育显著降低胰岛素诱导肝细胞TG的合成,并且显著降低了胰岛素诱导g6pd、6pgd和pparγ的表达,但不影响fas和cpt 1a的表达。本研究再次证明胰岛素促进肝细胞脂肪合成的作用,而这一作用能够被PI3K特异性抑制剂Wortmannin阻断,表明PI3K信号通路在胰岛素影响黄颡鱼脂肪沉积过程中发挥着重要作用。其次,AS1842856单独孵育结果显示:AS184285显著降低所有PI3K亚型的基因表达,并且pi3kcb和pi3kc3对AS1842856的敏感度更强。胰岛素与AS1842856共同孵育的结果显示:与对照组相比,AS1842856单独处理显著降低TG的合成;与胰岛素处理组相比,AS1842856处理显著降低胰岛素诱导TG的合成。与对照组相比,单独AS1842856处理不影响fas和6pgd的基因表达水平,但降低g6pd、pparγ、pparα和cpt 1a的表达水平。与胰岛素处理组相比,AS1842856提前孵育显著下降胰岛素诱导g6pd、6pgd和pparγ基因的表达。本研究表明,胰岛素促进肝细胞脂肪合成作用同样能够被FOXO1抑制剂AS1842856阻断,一方面说明FOXO1信号通路可能直接参与胰岛素调控脂肪代谢的合成作用,另一方面说明FOXO1抑制剂AS1842856很可能是通过抑制PI3K的转录水平来抑制PI3K信号通路,从而导致胰岛素利用PI3K信号通路促进肝细胞脂肪合成的作用再次被阻断。本研究表明AS1842856很可能从FOXO1和PI3K双重层面阻断胰岛素促进肝细胞脂肪合成作用。
【图文】：

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黄颡鱼 PI3Ks 功能解析及其信号通路在胰岛素调控肝脏脂代谢中的作用第一章文献综述1 磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）的研究进展磷脂酰肌醇 3 激酶（PI3K）能够催化细胞膜上的磷脂酰肌醇（PI）产生细胞内信号转导的第二信使 PIP3，进而募集和激活下游的靶物质，并启动一系列信号级联反应，在细胞的增殖、凋亡、存活以及代谢等细胞生物学进程中发挥着重要的作用（Foster et al 2003）。

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图 1.2 胰岛素信号通路对营养代谢调控示意图（Boucher 2014)Fig 1.2 Regualtion of insulin signal pathway on nurtrient metabolism.2.1 胰岛素胰岛素（insulin, Ins）是由胰岛 β 细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖乳糖核精氨酸和胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白激素，是糖代谢调节的重要参与者具有降低血糖的生理功效，其功能在人和部分哺乳类动物中已有很大进展。由于类天生对糖的利用率非常低，而胰岛素又是调控糖代谢的重要激素，因而鱼类的岛素及其信号通路的功能也受到越来越多的关注。胰岛素最先在机体内是以前胰岛素原（preproinsulin）形式存在，其基因序列前在 30 多种鱼类中已有报道（Caruso and Sheridan 2011）。胰岛素基因的结构主要括 3 个外显子和 2 个内含子。大部分鱼类如虹鳟（Oncorhynchus mykiss）等存在种胰岛素基因（Caruso and Sheridan 2011），而在大口黑鲈（Micropterus salmoides只存在一种（靳利娜 2011）。胰岛素基因编码的氨基酸个数大约 105~116 之间，
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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