香豆素类化合物抗鲤春病毒血症病毒活性及作用机制研究

发布时间：2020-06-01 20:25

【摘要】：鲤科鱼类是我国传统的养殖品种,养殖产量大,是人们餐桌上的美味佳肴。然而随着养殖规模的扩大,各种类型的传染病不断地发生和流行,对水产业造成了巨大的经济损失。鲤春病毒血症病毒(Spring viremia of carp virus,SVCV)引起的鲤春病毒血症(Spring viremia of carp,SVC)是对鲤科鱼类危害最大的传染病之一。由于病毒宿主范围广,病原极易扩散流行,因此SVC被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)规定为必须申报的动物疫病之一,而我国在新颁布的动物疫病名录中将其列为一类动物疫病。目前,尚无任何有效控制该病的药物、疫苗或其他方法,国际上通行的防控措施是对SVC进行严密监控,及早发现病鱼并进行隔离、扑杀,从而达到阻断该病暴发流行的趋势。本研究以全新合成的香豆素类化合物为研究对象,利用体外细胞分子水平筛选模型对化合物进行抗病毒活性评价,得到具有良好抗SVCV活性的香豆素。实验通过观察SVCV感染和药物处理后EPC(Epithelioma papulosum cyprini)细胞的形态学和各项生化指标的变化,以及使用多种细胞凋亡检测技术,对活性香豆素的抗SVCV活性作了进一步深入的研究。与此同时,本研究探索了两种抗病毒香豆素对SVCV感染细胞过程的影响和对宿主抗病毒反应的作用,以期为开发水产抗SVCV专用药物及SVC的防控提供理论基础。本研究取得结果如下:1.香豆素类化合物离体抗SVCV活性研究以49种香豆素类化合物为研究对象,通过实时定量PCR(qRT-PCR)技术检测SVCV G蛋白表达情况,体外筛选出的4种香豆素对SVCV增殖的抑制率超过90%,即7-[3-(苯并咪唑)丙氧基]香豆素(B4)、7-[4-(4-甲基咪唑)丁氧基]香豆素(C2)、7-[4-(苯并咪唑)丁氧基]香豆素(C4)和7-[6-(2-甲基咪唑)己氧基]香豆素(D5)。药物构效关系说明:不同取代基的咪唑类香豆素的抗SVCV活性要优于其他种类的化合物,其中,苯并咪唑和甲基咪唑取代基对化合物抗病毒活性贡献最大。细胞形态学和细胞活力检测显示上述4种香豆素显著地减弱了SVCV引起的细胞病变效应(cytopathic effect,CPE),并可维持EPC细胞生长活力,有效保护细胞免受病毒损伤。而相比之下,香豆素C4、D5处理感染SVCV的细胞后在72 h以内产生的细胞活力保护效应优于另外两种抗病毒香豆素B4和C2,因此,被选为后续实验的研究对象。药物浓度梯度实验进一步发现香豆素C4、D5对SVCV的N、P和M蛋白相对表达的最高抑制率同样超过90%,并在较短时间内快速进入细胞,一定时间内维持较高的胞内药物浓度。2.香豆素C4、D5抗SVCV诱导的细胞凋亡研究通过细胞荧光染色、扫描电镜和透射电镜观察发现SVCV感染诱导EPC细胞出现典型的凋亡特征,包括细胞核皱缩、细胞形态断裂、凋亡小体产生以及细胞骨架崩解等,我们证实SVCV可诱导EPC细胞发生细胞凋亡现象,而香豆素C4、D5则有效抑制细胞凋亡的发生。进一步的流式细胞术分析结果表明,SVCV感染EPC细胞48 h后,导致超过52%的EPC细胞发生细胞凋亡;随着病毒感染时间的增长,细胞凋亡率进一步增加,达到63.2%。而在加入香豆素C4、D5后,药物处理组的细胞凋亡率明显降低,正常细胞的比例超过80%,已接近对照组水平。另外,研究发现随着C4、D5浓度的增加,药物处理组的细胞凋亡率持续下降,药物浓度与细胞凋亡率之间呈负相关关系。Caspase酶活性检测结果反映出香豆素C4、D5可有效控制SVCV诱导Caspase凋亡信号的启动,避免细胞凋亡的发生。3.香豆素C4通过PKC-Nrf2/ARE通路抗SVCV研究通过测定香豆素C4对PKC-Nrf2/ARE通路活化的影响,探究该化合物的抗SVCV作用机制。实验结果显示,C4显著提高胞内SOD和CAT酶活性以及GSH含量,保护细胞免受SVCV造成的氧化损伤。另外,香豆素C4在不同程度上提高了PKCαThr638和PKCβSer660两个位点的磷酸化水平,从而激活Nrf2 Ser40位点的磷酸化,导致Nrf2入核蛋白量接近对照组的4倍,最终启动Nrf2/ARE抗SVCV通路。RNA干扰结果显示Nrf2/ARE通路的下游靶基因HO-1能够影响干扰素基因表达;而C4不仅可以显著提高HO-1基因的表达,同样对干扰素基因表达有促进作用。因此,香豆素C4的抗SVCV机制主要是利用PKCα/β两个亚基的磷酸化作用调控Nrf2/ARE通路促进HO-1表达,进而触发干扰素产生抗病毒反应。4.香豆素D5对SVCV G蛋白功能的作用研究通过研究香豆素D5对SVCV增殖的影响,发现该化合物在病毒感染前期干扰SVCV识别EPC细胞,抑制RNA由晚期内吞泡释放进入细胞质,最终发挥药物抗病毒作用。超速离心实验结果显示:在D5与SVCV粒子混合4 h后,SVCV G蛋白的扩增效率下降约90%,病毒滴度由10~(6.5±0.1)减小到10~(3.4±0.2),这说明D5可能对SVCV G蛋白结构造成一定破坏,从而降低病毒前期感染力和增殖力。通过构建SVCV G蛋白真核表达质粒,经过细胞转染、荧光显微镜和流式细胞术检测发现D5有效地抑制pEGFP-SVCV G质粒在EPC细胞内的表达,这个结果从另一方面证明了D5可以特异性作用于SVCV G蛋白,对G蛋白表达、功能产生影响。此外,香豆素D5显著地抑制Erk1/2的磷酸化作用,以激活Akt-mTor通路,减少EPC细胞内自噬小体的数量,降低SVCV诱导的细胞自噬水平,对SVCV在EPC细胞内的复制和病毒粒子的释放产生抑制作用。5.香豆素C4、D5在体抗SVCV活性研究通过注射方式研究香豆素C4、D5对斑马鱼死亡率和鱼体内病毒含量的影响,结果发现C4处理组斑马鱼的累积死亡率相对病毒组减少17.5%,D5处理组减少20%。斑马鱼脾脏和肾脏内SVCV G蛋白表达结果显示第1天和第4天鱼体内G蛋白的表达低于病毒组,反应了香豆素C4/D5的抗病毒作用。与此同时,这两种香豆素提高了斑马鱼体内的抗氧化酶活性,维持抗氧化-氧化系统平衡,并在SVCV复制前期通过激活鱼体干扰素表达对病毒增殖产生一定的抑制作用,最终降低SVCV对斑马鱼感染力。由此可见,香豆素C4和D5可以作为抗SVCV感染潜在的备选药物。综上所述,香豆素C4、D5分别通过宿主抗病毒反应和直接作用病毒结构蛋白对SVCV增殖产生强烈的抑制作用,能够在体外和体内显著地降低病毒量,有效地维持宿主细胞生长活力,减少感染病毒斑马鱼的死亡率。因此,香豆素C4、D5对防控SVC具有广阔的应用前景。
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析对先导化合物进行结构修饰进而产生拥有自主知识产权型植物源药物的研究热点，具有非常重要的经济和社会意界动物卫生组织（Office international des épizooties，OIE一（Ashraf et al. 2016），我国农业部所发布的《一、二、 SVC 列为一类动物疫病。SVC 通常在春季爆发，，并引起anellosetal.2006）。起初 SVC 主要流行于东欧和中欧国家。随着水产贸易的快速发展和鱼类新品种的引进，目前北流行（Ahneetal.2002；Dikkeboometal.2004；Fijan1999；Te我国尚未有该病大规模爆发的报道，但已从患病的金鱼、出 SVCV（Liu et al. 2004）。理变化

示意图,病毒结构,基因组,示意图

而研发的灭活苗和弱毒苗在鱼体内虽然能产生一定足，如造价高、保护力不强以及安全性低等。新兴的 DNA优点，成本低、易生产和储存；而多价苗将多个编码抗原的建质粒，能够高效率的抗多种病害。当前在水产养殖业中，疫苗已显示出良好的应用价值，但至今无 SVCV 新型疫苗员认为今后需要为水产疫苗的发展建立一套可灵活应用的模力、安全性和是否能通过当地的法规、符合当地流行病学情开发 SVCV 疫苗（包括活苗、灭活苗、亚单位苗和核酸苗） et al. 2016）。究进展特征A
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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