青鱼感染嗜水气单胞菌路径及转录组初步研究

发布时间：2020-06-03 07:27

【摘要】：青鱼(Mylopharyngodon piceus)是我国的“四大家鱼”之一,是中国淡水养殖的重要经济种类。青鱼在自然条件下受大量病原微生物的影响,嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是引起青鱼患细菌性败血症的主要病原体,青鱼患病后死亡率极高,这对青鱼养殖造成了严重的经济损失。本研究通过GFP荧光蛋白标记嗜水气单胞菌,观察嗜水气单胞菌在青鱼体内的感染路径。通过转录组探究了抗病和易感青鱼免疫应答的差异。基于转录组的数据对青鱼MpMyD88基因进行了鉴定和功能分析。在本研究中获得的结果如下:将重组质粒(p-GFPuv-K)转化到嗜水气单胞菌中并成功表达,其与野生菌株的半致死浓度(LC50)和生长曲线类似。检测了青鱼感染标记菌株后72小时内青鱼的鳃、肝、脾、肠、体肾、头肾、肌肉、眼、脑、心脏组织和血液中嗜水气单胞菌的数量。数据表明青鱼的鳃、肠和受伤的皮肤,是嗜水气单胞菌进入体内主要的途径,血液是嗜水气单胞菌在体内传播的介质之一,养殖密度的增加会增加病菌的感染时间。在转录组研究中,共有5243个基因在GO(Gene ontology)分析中被富集,并且在KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome)分析中发现了323个相关通路。共发现了1935个差异表达的基因,主要参与细胞粘附,病原体识别,细胞免疫,细胞因子,补体系统和铁转运。在转录组数据中筛选出MpMyD88基因,其cDNA全长为1658bp,开放阅读框长度为855bp,编码284个氨基酸的蛋白质。该蛋白质具有保守的死亡结构域和典型的TIR结构域。发现MpMyD88广泛分布在测试的组织中。MpMyD88过表达或敲降后,细胞因子(TNF-α,IFN-α,IL-6,IL-8)也相应的出现显著的上调或下降。过表达MpMyD88的细胞抗菌能力显著强于对照组,而敲降组则显著低于对照组,并发现MpMyD88基因的过表达显著提高了NF-κB的活性。
【图文】：

组质粒以及标记菌株筛选（A）质粒结构图谱（B）含有 p-GFPuv-K 质粒的 DH5下具有荧光（C）AH4332GFPuv在 UV 灯下具有荧光（D）AH4332GFPuv传代培养第十天菌株荧光。 1 Recombinant plasmid and screening of fluorescently labeled strains. (A) Map of plasmre. (B) DH5α containing p-GFPuv-K plasmid is fluorescent under UV light. (C)AH4332Gorescence under UV light. (D) The fluorescence ofAH4332GFPuvon the tenth day of subcu-GFPuv-K 质粒稳定性以及 AH4332GFPuv菌株的特征鉴定过 2.4 中所述的方法，标记菌株在 LB 培养基中培养至第 10 天后，将的菌液稀释 1000 倍后，在含有 Kana 的 LB 固体培养基中，，发现所有的 灯照射下都有荧光（图 1D），即，p-GFPuv-K 在 AH4332GFPuv 中能够

为了更好的比较 AH4332GFPuv 和野生菌株的在生长速率上的差异，通过 2中所述的方法绘制了 AH4332GFPuv 和野生菌株的生长曲线（图 2A），从图中发两株菌的生长曲线十分相近，其对数生长期，以及最高峰值时间基本一致。在半致死浓度的比较中，发现在不同的病菌浓度下，被两株菌感染的青鱼的活率基本一致，如图 2B，从图中看到两株菌的半致死浓度都在 4.8 107，而且在他浓度下的存活率也十分接近。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

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本文编号：2694502