IHHNV病毒蛋白与凡纳滨对虾围食膜蛋白的互作研究

发布时间：2020-06-03 16:06

【摘要】：本研究采用SMART技术成功构建了凡纳滨对虾肠道组织的全长cDNA文库,经电子拼接和序列比对分析获得了凡纳滨对虾围食膜蛋白基因(Peritrophin)全长序列,该基因包含一个长度为828bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码275个氨基酸,理论分子质量约30.782 kDa。进一步对所获得的序列进行比对分析,结果显示该序列与斑节对虾的相似性77.3%,与短沟对虾的相似性为76.1%,与中国对虾的相似性为72.2%,与墨吉对虾的相似性为62.3%。根据比对结果选取一段保守的凡纳滨对虾围食膜蛋白基因(L.vannamei Peritrophin, LvPT)序列进行后续蛋白功能研究,LvPT序列长为687bp,编码228个氨基酸,理论分子质量约25.829kDa。根据IHHNV福建株(GenBank NC_002190.2)的序列,设计开放阅读框CP、NS1和NS2的融合表达载体引物,并构建酵母穿梭表达质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1、pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT;酵母穿梭质粒经DDO/X/A检测无自激活现象后用于蛋白互作研究。将重组菌株Y2HGold (pGBKT7-CP, pGBKT7-NS1, pGBKT7-NS2)分别和重组菌株Y187 (pGADT7-LvPT)融合mating,经DDO/X/A初步筛选发现均有相互作用,经QDO/X/A筛选发现pGBKT7-CP和pGADT7-LvPT, pGBKT7-NS1和pGADT7-LvPT存在较强的相互作用,而pGBKT7-NS2和pGADT7-LvPT之间的作用较弱,怀疑其为假阳性。由此可见,LvPT蛋白与IHHNV病毒间产生相互作用,而且有可能直接影响病毒侵袭机体的过程。此外,我们采用RNAi的方法,体外合成dsLvPT后,进行体内注射干扰LvPT基因的表达,研究IHHNV病毒在凡纳滨对虾体内复制是否受到抑制。结果表明,注射dsLvPT后,LvPT表达下调,IHHNV病毒的相对拷贝数与对照组相比显著降低。进一步说明LvPT与IHHNV病毒感染凡纳滨对虾的机制有关。此外,我们通过western-blot检测发现LvPT可以在High-Five昆虫细胞中表达,为进一步研究LvPT与IHHNV病毒编码的蛋白间的相互作用机制奠定了基础。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.49

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