乳酸乳球菌的分离及作为溶藻弧菌DNA疫苗投递载体的研究

发布时间：2020-06-04 21:27

【摘要】：鉴于溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)对渔业生产的严重影响,研发抵抗该菌感染的疫苗成为目前迫切的需要。而在水产养殖中乳酸菌作为益生菌能改善养殖的水环境、促进养殖动物肠道内微生物平衡、提高其抗病力等。本研究拟结合益生菌和疫苗的长处,从健康石斑鱼肠道中分离鉴定乳酸菌,并将溶藻弧菌免疫保护原基因VscO通过分子生物学技术插入至乳酸菌构建组成型重组乳酸菌株,并对该组成型重组乳酸菌株的生物学特性、安全性和免疫保护等进行了研究。其结果如下:1、从健康的珍珠龙胆石斑鱼中分离得到3株乳酸菌ZJS01-ZJS03,结合生理生化方法以及分子生物学手段鉴定3株乳酸菌都为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。安全性检测表明三株乳酸乳球菌均为安全性菌株;药敏试验结果表明三株菌株均对氨基糖类、喹诺酮类多数、复方新诺明、多念菌素B和氨曲南表现为耐药,对青霉素类多数、四环素类、大环内脂类及克林霉素、氯霉素敏感和头孢类抗生素表现为敏感;细菌拮抗结果表明三株乳酸菌均对大肠杆菌(E.coli DH5α)无抑制作用,对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harnyi)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)都有较显著的抑制作用,其中对溶藻弧菌和副溶血弧菌抑菌效果最好,抑菌直径为21.5-23.5 mm。2、通过分子生物学技术将溶藻弧菌HY9001株Vsco基因,构建了能表达Vsco基因组成型重组乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco;Western blotting验证Vsco基因在乳酸乳球菌中的表达情况,结果表明,重组的乳酸乳球菌能表达出约18 kDa VscO蛋白,并且具有良好的反应原性;质粒遗传稳定性结果表明:连续培养45代后,质粒遗传特性稳定。3、为了检验构建好的乳酸菌能否能诱导肠道黏膜和系统免疫应答,将组成型重组乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco包被于颗粒饵料投喂珍珠龙胆石斑鱼(Pearl gentian grouper),ELISA检测各组石斑鱼血清样品中特异性IgM抗体、ACP、SOD以及Lysozyme活性水平,结果表明,对比对照组,重组乳酸菌组中所有石斑鱼血清中IgM抗体、ACP、SOD和Lysozyme活性水平显著增高。通过实时荧光定量PCR的方法检测相关组织中的IL-1β、IL-10、TNF-α和MHC-1α免疫基因表达水平变化,结果表明,虽然野生菌株也均能显著加强石斑鱼主要免疫器官头肾和脾脏中IL-1β、IL-10、TNF-α和MHC-1α基因的转录水平,但重组菌株组中上述免疫基因表达水平显著高于野生菌株组(P0.05),从而提高石斑鱼的免疫保护力和抗病能力。4、对上述投喂组成型重组乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco的石斑鱼用溶藻弧菌强毒株HY9901腹腔注射进行攻毒实验,结果表明重组菌株和野生菌株都能缓解病原菌的感染,具有一定的保护作用,重组菌株的免疫保护率达到68%,重组菌株的免疫效果高于野生菌株组(55%)。总之,本研究构建表达溶藻弧菌Vsco基因的重组乳酸菌Lc-pMG36e-Vsco,经口服免疫珍珠龙胆石斑鱼后能刺激机体产生特异性IgM抗体和相关酶类,并能促进机体内相关细胞因子的表达,提高了机体的体液免疫应答和增强机体的免疫力,为研发口服乳酸菌或乳酸菌活载体疫苗的应用提供了依据。
【图文】：

电泳图,电泳图,乳酸乳球菌,菌株

乳酸乳球菌的分离及作为溶藻弧菌 DNA 疫苗投递载体的研究菌株均能在 28 ℃、32 ℃、37 ℃及含 0%、2%、4%、8% NaCl MRS 液体培养中生长。2.3.2 分离菌的生化特征和 16s rRNA利用传统方法和乳酸菌鉴定试剂条对 9 株乳酸菌的生理生化特性分析（表 1）。结果表明，ZJS01、ZJS02、ZJS03 三者菌株生理生化特征完全一致性，与乳酸乳球菌(NZ9000)标准菌株相同，比如过氧化氢酶、葡萄糖产气试验、明液化试验和产 H2S 试验结果均为阴性；石蕊牛奶试验、葡萄糖产酸试验、葡聚产生试验、精氨酸水解试验和 V-P 试验结果均为阳性。糖发酵鉴定结果可知株菌株均能发酵七叶苷、纤维二糖、麦芽糖、甘露糖、水杨苷、蔗糖、菊糖和糖，，不能发酵山梨醇和棉籽糖。由上述结果初步判断 3 株菌株为乳酸菌（表 2.通过 16s rRNA 结果发现 3 株分离菌株均为乳酸乳球菌（图 2.1）。

序列,16SrRNA序列,系统进化树

ZJS01- ZJS03 都和乳酸乳球菌有很高的同源性，高达 98%-99%（图2.2），由此可知，分离得到的三株乳酸菌均与乳酸乳酸菌聚为一支。2.3.4 安全性评价通过口腔灌胃乳酸乳球菌到珍珠龙胆石斑鱼体内，用商品化石斑鱼饲料投喂，经过一段时间的观察结果发现，鱼体并无出现异常行为且均存活，说明了该分离得到的乳酸乳球菌时安全的，可用于作为后续实验。2.3.5 抗生素敏感性根据 WHO 提供的 NCCLS (clinical and laboratory standards institute)最新版本对敏感或耐药的判断标准，分析 3 株乳酸菌对 7 大类 34 种抗生素的药敏结果(表2.2)。试验结果表明，3 株乳酸菌均对头孢唑啉、氨苄西林、青霉素 G、哌拉西啉、米诺环素、克林霉素、四环素、克拉霉素、红霉素和氯霉素敏感，此外，对头孢呋辛、头孢曲松、头孢吡肟、头孢西叮、头孢哌酮、头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻吩、万古霉素、苯唑西林、大观霉素、氧氟沙星、左氟沙星也表现为敏感,图 2.2 基于 16S rRNA 序列构建的系统进化树Fig. 2.2 Phylogenetic tree of golden pompano bacterial isolates and otherStreptococcus species reference strains from GenBank, based on the16SrRNAgene
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.4

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