黄河鲤鱼2-Cys型过氧化物还原酶基因的分子克

发布时间：2020-06-04 22:52

【摘要】：鲤鱼是我国重要的水产经济动物,黄河鲤鱼是鲤鱼中的一个重要的地方品种。近年来,由于人类活动因素的影响,如过度捕捞,滥捕滥杀,河流污染,天然繁殖基地被隔离以及黄河自然断流等,这些因素严重破坏着黄河流域的生态平衡,使得黄河鲤鱼的资源总量急剧下降。伴随着黄河鲤鱼养殖规模的扩大,疾病发生频繁,严重制约了黄河鲤鱼养殖业的健康发展,黄河鲤鱼抗病研究越来越受到重视。过氧化物还原酶(Peroxiredoxin,Prx)是抗氧化酶家族成员之一,广泛存在于各种生物体内,能够通过消除细胞内的烷基过氧化氢和过氧化氢等氧化攻击,维持细胞内氧化还原平衡。本文以我国重要的淡水养殖鱼类黄河鲤鱼为实验材料,对黄河鲤鱼典型2-Cys Prx基因中的Prx3和Prx4进行研究,目的是阐明抗氧化蛋白Prx在黄河鲤鱼免疫系统中的作用机制,为鱼类抗病防御机制的研究提供有效的理论依据。依据NCBI中提供的鲤鱼全基因组序列信息,采用RT-PCR方法,从黄河鲤鱼肝脏中克隆得到Prx3和Prx4。Prx3基因组全长是2816 bp,其中5,端不翻译区(Untranslated Regions,UTR)为196 bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为753 bp,编码250个氨基酸,推导其编码蛋白的分子量是27.01kDa,理论等电点为8.25。Prx4基因组全长是3475 bp,其中开放阅读框为783 bp,编码260个氨基酸,推导其编码蛋白的分子量是29.11 kDa,理论等电点为5.98。Prx3蛋白的二级结构包含29.60%α-螺旋和7.20%β-折叠;Prx4二级结构包含31.15%α-螺旋和10.77%β-折叠。对Prx3和Prx4进行同源性分析发现,黄河鲤鱼和其他所分析的鱼类均含有共同的保守催化中心“FTFVCPTEI”和“GEVCPA”。经序列对比及系统发育进化树分析表明黄河鲤鱼Prx3和Prx4与斑马鱼、新月鱼、棘鱼的过氧化物还原酶基因具有非常高的同源性。转录水平分析显示,Prx3和Prx4基因在黄河鲤鱼的12个组织(性腺、肝脏、肌肉、鳍、鱼鳔、眼、脑、鳃、脾脏、肠、肾脏、心脏)中均有表达,其中Prx3在肾脏中的表达量最高,肌肉次之,在鳍中表达量最低。Prx4在肾中的表达量最高,在性腺中的表达量较低于肾脏,在鱼鳔中表达量最低。腹腔注射嗜水气单胞菌后,提取其肝,脾和肾3个组织进行表达变化分析,发现在不同的时间段这3个组织Prx3和Prx4都有明显的变化。在感染6h后,肝脏和脾脏中的Prx3和Prx4的表达量显著增加,之后逐渐下降。在肾脏中,感染6h后Prx3和Prx4的表达量显著下降,之后有上升趋势。这显示了Prx3和Prx4在黄河鲤鱼遭受病原菌感染时具有较强的应答水平。扩增Prx4基因的成熟肽后,Sal I、EcoR I双酶切扩增片段和原核表达载体pMAL-c5x,构建获得重组质粒pMAL-c5x-Prx4,经酶切和测序鉴定,目的基因正确插入表达载体,将其转入E.coli BL21中,构建重组表达质粒菌E.coli BL21/pMAL-c5x-Prx4,SDS-PAGE检测表明,Prx4能在E.coli BL21中以可溶性重组蛋白的形式表达,表达产物的分子量约为72kDa。Western Blot表明,Prx4蛋白在黄河鲤鱼的肝脏、鳃、眼等组织中均有表达。对纯化的Prx4重组蛋白进行酶活性分析,结果表明重组蛋白Prx4在DTT存在的条件下能还原H2O2。纸片扩散法进一步验证了重组蛋白Prx4能保护大肠杆菌(BL21)细胞抵抗氧化应激。本文的结果证明了Prx3和Prx4在黄河鲤鱼中的表达特征和抗氧化活性。
【图文】：

ys 型过氧化物还原酶基因的分子克隆、原核表3 结果与分析鲤鱼各个组织和不同感染时间段的鲤核酸蛋白测定仪检测 RNA 浓度值，的污染程度较少，适合进行下一步图 3.1），这说明 RNA 完整无降解

这说明 RNA 完整无降图 3.1 黄河鲤鱼组织总 RNA 电泳图谱trophoresis pattern of total RNAin Yellowx4 基因 ORF 克隆，在基因的保守区域设计的引基因序列，利用上述引物，经胶电泳后，得到一条约为 75
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78

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本文编号：2697090