牙鲆microRNA pol-miR-194a和pol-miR-3p-2的调控机制及在迟缓爱德华氏菌感染过程中的作用研究

发布时间：2020-06-05 11:40

【摘要】：MicroRNA(miRNA)作为转录后调控的重要手段,广泛参与生物体多种生理过程的调控。在病原与宿主的博弈过程中,miRNA同样扮演着重要角色。实验室前期研究发现了大量免疫调控相关的牙鲆miRNAs。在此基础上,本研究鉴定了两条参与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda,E.tarda)感染过程的牙鲆miRNAs,pol-miR-194a和pol-miR-3p-2,并探索了二者的调控机制及在E.tarda感染过程中的免疫调控作用。我们首先检测了pol-miR-194a对E.tarda感染的响应。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)的方法,发现在E.tarda感染24 h后,牙鲆的肝脏、脾脏和鳃中pol-miR-194a的表达量均显著上调。利用荧光素酶报告实验,我们发现pol-miR-194a能够与干扰素调节因子7(Interferon regulatory factor 7,IRF7)的3’UTR相互作用,表明IRF7是pol-miR-194a的一个靶基因。同时,通过对IRF7靶序列及pol-miR-194a种子序列的突变实验,证明了pol-miR-194a与IRF7-3’UTR的相互作用依赖于完整的种子序列。进一步研究发现,在牙鲆鳃细胞系FG-9307细胞中过表达pol-miR-194a后,内源性IRF7的蛋白表达水平显著降低。为了验证pol-miR-194a对IRF7下游信号通路的调控,将pol-miR-194a mimic(pol-miR-194a模拟物)和I型干扰素的启动子报告质粒共转染到FG-9307细胞中,结果发现pol-miR-194a mimic能够显著抑制I型干扰素启动子的活性。通过体外过表达实验和胞内复制实验,我们发现pol-miR-194a能够增强E.tarda在宿主细胞内的复制。以上实验表明,pol-miR-194a表达受E.tarda调控,而pol-miR-194a下调牙鲆IRF7和I型干扰素的表达,进而降低牙鲆的抗感染免疫应答,最终促进E.tarda的胞内复制。自噬在多种生理过程中发挥重要作用,如生长发育、肿瘤发生、炎症反应以及病原感染与宿主的免疫调控等。在本研究中,我们发现E.tarda感染能够诱导牙鲆脾脏免疫细胞和牙鲆FG-9307细胞系的自噬现象。p53在自噬过程中发挥着重要作用,同时被预测为牙鲆pol-miR-3p-2的靶基因。利用qRT-PCR实验,我们发现在E.tarda感染24 h后,牙鲆的肝脏、脾脏和鳃中pol-miR-3p-2的表达量均显著上调。通过荧光素酶报告实验和western blot分析,我们确认p53是pol-miR-3p-2的靶基因。在FG-9307细胞中过表达pol-miR-3p-2能够激活细胞自噬。进一步研究发现,在FG-9307细胞中敲降p53后,自噬关键蛋白Beclin的表达水平上调;在HEK293T细胞中异源表达实验进一步确认p53敲降能够上调Beclin的表达。通过体外过表达实验结合胞内复制实验,我们发现pol-miR-3p-2能够抑制E.tarda的胞内复制。以上结果表明,E.tarda感染能够促进pol-miR-3p-2的表达,进而下调p53蛋白表达,并上调Beclin的表达,从而促进牙鲆免疫细胞发生自噬,抑制E.tarda的胞内复制。综上所述,我们阐释了两条牙鲆miRNAs,pol-miR-194a和pol-miR-3p-2,的调控机制,并揭示了二者在E.tarda感染过程中的作用。这些研究结果促进了我们对鱼类miRNAs作用机制以及E.tarda感染机制的理解。
【图文】：

E. tarda 通常先侵染上皮细胞和肠上皮组织（图1.1）。在某些情况下，E. tarda 能够侵染到宿主更深的部位，被吞噬细胞摄入。在生存环境的选择上，E. tarda 更倾向于在宿主细胞内生活，如上皮细胞和吞噬细胞，以更好地逃避宿主天然免疫系统的杀伤，利于自身存活和增殖 (Leung etal., 2012b)。在感染的开始，E. tarda 利用其鞭毛靠近和接触宿主上皮细胞（如

参与多种生理过程的调控。在过去的二十年间，，越和致病过程，都发现了 miRNAs 的参与 (Chandra 2016)。据估计，大概 60%的人类蛋白编码基因受et al., 2008)。因可以编码单个 miRNA 或者两个及以上的 miRNA自于命名为 primary-microRNA（pri-miRNA）的初2004)。pri-miRNAs 在核 RNAse III 核糖核酸内切酶大概在 70 个碱基的中间产物，命名为 pre-miRNA质 RNAse III 内切酶（Dicer 酶）的作用下，形成双为 22 个碱基左右的成熟 miRNAs （图 1.2）。在 miRNA 双链中的一条参与形成 RNA 介导的silencing complex，RISC），介导 RISC 靶向目的 m (Tomari et al., 2007)。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

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本文编号：2697995