嗜水气单胞菌ompF和ompK的原核表达及对欧洲鳗鲡的免疫保护作用

发布时间：2020-06-07 01:30

【摘要】：嗜水气单胞菌是淡水养殖中的主要致病菌,可引起爆发性的败血症,给水产养殖产业带来了非常严重的经济损失。嗜水气单胞菌高效亚单位疫苗的制备和研发在减少抗生素的使用、保持水产品安全等方面具有积极的意义。本文以该菌外膜蛋白ompF和ompK为研究对象,评价了其对欧洲鳗鲡的免疫保护效果,旨在为开发嗜水气单胞菌高效亚单位疫苗提供备选材料。以一株致病性鳗源嗜水气单胞菌作为研究材料,通过SDS-PAGE分析了该菌株外膜蛋白的组成,分别用欧洲鳗鲡感染嗜水气单胞菌全菌后的恢复期血清和兔抗嗜水气单胞菌外膜蛋白的血清进行Western-blot印迹分析,发现28、37、43和45 kD的4个蛋白条带都发生了阳性反应。同时通过SDS-PAGE对比了这5株不同气单胞菌的外膜蛋白组成,发现分子量为28 kD的外膜蛋白为这5株气单胞菌所共有。对含量最大的37 kD和不同菌株共有的28 kD这两种外膜蛋白进行质谱测序,匹配得到的外膜蛋白分别为ompF和ompK,以这两种外膜蛋白作为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的进一步研究对象。以嗜水气单胞菌的总DNA作为模板,分别构建pET-32a-ompF和pET-32a-ompK两种原核表达质粒,制备得到高纯度的r-ompF和r-ompK。Western-blot证实两种重组蛋白都具有抗原性。分别用所制备的嗜水气单胞菌的重组蛋白r-ompF和r-ompK作为免疫原,腹腔注射免疫欧洲鳗鲡。在免疫后的第1h、3 h、6 h、12 h、24 h、72 h和10 d分别采取欧洲鳗鲡的肝脏组织,进行RNA的提取和逆转录,通过荧光定量PCR检测三个免疫相关基因(IRF3、IgMa1和IgMb1)的mRNA表达量。结果发现,r-ompF和r-ompK对于欧洲鳗鲡的三个免疫相关基因都具有上调作用,其中r-ompK上调幅度明显更大。在免疫后的第15d对欧洲鳗鲡进行嗜水气单胞菌活菌攻毒处理,评价r-ompF和r-ompK的免疫保护率。结果发现,r-ompF蛋白对欧洲鳗鲡的相对免疫保护率为35.3%,而r-ompK蛋白提供的相对免疫保护率可以达到70.0%。综合两种重组蛋白对欧洲鳗鲡的免疫保护效果和对其肝脏组织中三种免疫相关基因的调控作用的比较,本研究发现重组外膜蛋白r-ompK更适合于作为嗜水气单胞菌亚单位疫苗的候选成分。
【图文】：

Ｆｏｌｈｉ－酚法测得所提取外膜蛋白的含量为２．１邋ｍｇ／ｍＬ。逡逑３．２菌株外膜蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱逡逑菌株３２２Ａ外膜蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱如图１所示，菌株外膜蛋白条带有逡逑１３条，其中主要条带有９条，分子量分别为１０３、４５、４３、３７、３３、２８、２０、１８逡逑和１６邋ｋＤ，另有一些较为模糊的条带，如６７、５４、５０和３９邋ｋＤ。逡逑１３逡逑

以嗜水气单胞菌的总ＤＮＡ作模板，，采用设计的引物对外膜蛋白ｏｍｐＦ和逡逑ｏｐｍＫ的基因片段分别进行ＰＣＲ的扩增。扩增得到的产物采用１％的琼脂糖凝胶逡逑电泳进行分析，得到的电泳图片能够看到明显的特异性条带。其中图５可以看到逡逑ｏｍｐＦ的ＰＣＲ扩增产物为９８０邋ｂｐ左右，图６可以看到ｏｍｐＫ的ＰＣＲ扩增产物为逡逑８１０邋ｂｐ左右，片段长度符合己经发表的基因片段长度。逡逑１邋２逡逑２Ｑ00ｂｐ—逡逑ｉ000ｂｐ—｜５＾：媜逡逑７５０ｂｐ——逡逑：二

本文编号：2700598