牡蛎疱疹病毒魁蚶株交叉引物等温扩增检测方法的建立及贝类派琴虫流行病学调查

发布时间：2020-06-08 03:31

【摘要】：牡蛎疱疹病毒魁蚶株(SB strain of Ostreid herpesvirus-1,Os HV-1-SB)是由2012年6月本实验室从山东长岛、莱州、日照和即墨等地的养殖基地魁蚶样品中检测获得,其感染健康魁蚶后,主要表现为反应迟钝、触碰后双壳不闭合或闭合缓慢,外套膜内缩,内脏团呈灰白色或黑灰色。出现上述症状的个体一般1d内就会死亡,其死亡率可达到75%,目前关于该病毒的有效检测方法尚未建立。本论文根据本实验室已测序完成的Os HV-1-SB全基因组序列,运用交叉引物等温扩增(cross priming amplification,CPA)技术,通过对反应条件的优化、CPA产物的酶切鉴定、CPA灵敏度实验、CPA特异性实验和实际样品的检测,为Os HV-1-SB建立了一种现场简单、快速、高灵敏度的检测方法。同时,运用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术对2010年全年实验室采集贝类样品中派琴虫感染情况进行了流行病学调查,以期为派琴虫的有效防控提供一定的理论依据。研究方法和部分结果如下:第一部分:根据本实验室已测序完成的Os HV-1-SB全基因组序列(文未发),选择其保守区域作为CPA反应的靶序列,使用Primer Explorer 4.0引物设计软件,设计出一套CPA反应引物,并对反应体系的温度、d NTPs和Mg2+浓度和反应时间进行了优化。结果显示,最佳温度为63℃,反应时间为60 min,d NTPs浓度为1.4mmol/L,Mg2+浓度为6 mmol/L。该方法检测灵敏度为30拷贝的质粒DNA,并且特异性较强,与贝类常见病原急性病毒性坏死病毒、鲍鱼疱疹病毒、派琴虫、包纳米虫、马尔泰虫以及对虾白斑综合征病毒和副溶血弧菌均无交叉反应。并使用实验建立的CPA检测方法对2012年分别采自韩国庆尚南道、山东长岛、辽宁大连共计22份Os HV-1-SB感染情况未知的魁蚶样品进行了检测。研究表明,实验所建立的Os HV-1-SB的CPA检测方法简单、快速、灵敏且特异性强。由于其检测结果可通过简单离心观察白色沉淀或者向反应管中加入核酸荧光染料Gene FinderTM通过颜色变化进行阴阳性判断,所以可以在沿海条件简陋的贝类养殖厂及实验室使用,具有较好的应用前景。第二部分:派琴虫是危害贝类养殖业的主要寄生虫,实验通过对2010年全年采自山东青岛、山东荣成、山东长岛、广东惠安和福建霞浦的共计548份贝类样品,提取核酸后使用OIE推荐的PCR检测方法对派琴虫进行了检测。结果显示,全部样品中奥尔森派琴虫的阳性率达到了21.17%,其中青岛流清河贝类样品中栉孔扇贝(蓬莱红和野生苗)阳性率为22.00%,贻贝阳性率为55.00%;荣成桑沟湾栉孔扇贝(蓬莱红、野生苗和人工苗)阳性率为16.30%,贻贝阳性率为18.52%;烟台长岛县贝类样品阳性率较低,只有皱纹盘鲍检测到阳性,栉孔扇贝野生苗和虾夷扇贝中均没有检测到奥尔森派琴虫。同时,对各月份采集贝类样品奥尔森派琴虫的整体阳性比率进行汇总分析,结果显示,奥尔森派琴虫感染主要发生在夏季水温较高季节,其中在7月达到了峰值。而在1、2、12月水温较低时期,未检测到奥尔森派琴虫感染阳性样品。第三部分:急性病毒性坏死病毒(AVNV)是阻碍栉孔扇贝养殖业发展的主要病原,本文根据已完成的AVNV全基因组序列,通过PCR技术得到编码AVNV多重跨膜蛋白的ORF110基因,并进行了TA克隆得到p MD18-T-110质粒,经限制性内切酶Sna BⅠ和NotⅠ双酶切后和真核表达载体p PIC9K连接、转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞,构建得到用于蛋白表达的重组质粒p PIC9k-ORF110。经电转化后,将重组质粒整合到毕赤酵母GS115中,使用甲醇进行了诱导表达,同时在表达过程中使用光学显微镜对酵母形态进行了观察,以便确认表达过程中无杂菌污染。
【图文】：

反应体系,温度

图 2-1 OsHV-1-SB CPA 反应体系温度优化2000TMDNAMarker；1~6：分别对应 59、61、63、65、67 和 691 Optimization of the reaction temperature of the OsHV-1-SB CPAasDNAMarker；Lanes 1-6 are different reaction temperatures: 59, 61, 6

反应体系,单一变量,浓度,电图

浓度的优化结果应温度基础上，单一变量对 CPA 体系中 MgCl2浓度进泳显示，当反应体系中 MgCl2浓度为 6 mmol/L 时，电图 2-2）。因此，，在 OsHV-1-SB CPA 反应体系中以 6 mA 的最佳 MgCl2浓度。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S944

【参考文献】