翘嘴鳜microRNA转录组及与生长发育相关miRNA的鉴定与分析

发布时间：2020-06-10 07:50

【摘要】：翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)隶属鲈形目(Perciformes)、鳜亚科(Sinipercinae)、鳜属(Siniperca),是我国淡水优质鱼类。至2014年,全国鳜鱼产量已达293 853吨,广东、江西、安徽等地区是主要养殖省份。养殖密度的增加导致水体生态环境恶化;长期人工繁殖忽视亲本选育,导致鳜鱼种质退化,出现生长速度下降及抗病力降低的问题。因此,选育生长快的品种对鳜鱼养殖至关重要。体重是衡量鱼体生长发育的重要指标之一。骨骼肌占活鱼体重的30%~80%,是鱼体的主要组成部分,也是研究鱼类生长的重要材料。大多数鱼类在出生后通过肌纤维的不断增生和肥大两个过程进行肌肉生长,肌肉的生长发育过程被生长因子、调控蛋白、miRNA、促分裂素原活化蛋白激酶(MAPK)通路、Wnt/β-catenin信号通路等多水平精确调控。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性、长度约22 nt非编码小RNA,主要通过种子序列与靶基因mRNA的3’端非翻译区(3’-UTR)结合调控基因的表达水平从而参与生物体的生长与发育、疾病等多种生理过程。在本研究中,我们以生长存在显著差异的慢长组、快长组翘嘴鳜肌肉为材料,采用Illumina HiSeq深度测序技术、生物信息学及实验方法,初步筛选与生长发育相关的miRNA,以期为鳜鱼分子选育种提供候选基因。主要研究内容如下:1.翘嘴鳜miRNA的鉴定及保守miRNA碱基编辑情况统计本研究通过HiSeq高通量测序对慢长组和快长组进行miRNA转录组测序,组装、拼接后分别获得11241781和11410753条干净序列。与miRBase数据库比对,一共获得翘嘴鳜保守miRNA 433个,其中快长组有413个,慢长组410个。统计已知miRNA碱基编辑情况,结果显示在快长组、慢长组中分别发生2336、2143处碱基编辑,其中出现次数较高的编辑类型是G-to-U与U-to-C,出现次数较低的编辑类型是C-to-U与C-to-A。miRNA编辑不仅增加了miRNA转录组的功能多样性,也是转录组进化稳定的特征。这些数据的获得与分析丰富了鳜鱼转录组信息。2.快长与慢长组差异表达miRNAs的鉴定与q-PCR验证采用Expdiff方法在快长与慢长组间鉴定出8个差异miRNAs,进一步通过实时荧光定量qRT-PCR试验验证这些差异表达的miRNAs。其中miR-122、miR-192、miR-200b-5p、mi R-451在慢长组中显著上调;而let-7j-5p、mi R-499-5p、miR-10b-3p、miR-204-3p则在快长组中显著上调。经实时荧光定量RT-PCR方法验证:miR-122、mi R-192、miR-451在慢长组中高表达,它们在两组间均存在显著差异(p0.05),与测序结果一致,但miR-200b-5p则为显著低表达;验证结果显示let-7j-5p在快长组中也为高表达,但miR-499-5p、miR-10b-3p却为低表达,其中let-7j-5p和miR-499-5p在两组间均为显著差异,而miR-10b-3p则为极显著差异;miR-204-3p在两组间则差异不显著。这一结果为进一步了解miRNA对翘嘴鳜生长发育的调控提供基础。3.差异表达miRNAs的靶基因预测及KEGG通路注释利用软件RNAhybrid和Targetscan对差异miRNA进行靶基因预测,将靶基因进行KEGG Pathway显著性富集分析。取两个软件预测结果的交集,获得36 065个miRNA-靶基因mRNA,分析miRNA-靶基因交互作用的遗传多态性的数据,以期对翘嘴鳜分子育种提供有用信息。mRNA经KEGG富集分析可注释到307个信号通路,这些通路涉及生长、代谢、发育等发面。其中Wnt信号通路是一个重要的鱼类骨骼肌信号通路。4.qRT-PCR分析翘嘴鳜miR-192的胚胎表达模式miR-192是上述研究中发现的差异表达miRNA之一,通过实时荧光定量qRT-PCR对其胚胎表达模式进行分析,结果发现miR-192为母源性表达基因,在未受精的鱼卵中能检测到表达,在受精卵到开口期表达量呈现先下降后上升趋势:在未受精卵、受精卵和多细胞期都有大量表达,之后在囊胚期其表达量急剧下降;从原肠胚期到肌肉效应期仅检测到其极低表达量;而从出膜期到开口期表达急剧上升。miR-192可能在翘嘴鳜胚胎的分化发育过程起重要作用。
【图文】：

示意图,示意图,聚合酶,剪切体

图 1 miRNA 合成示意图Figure 1 miRNA biogenesis pathway（Farazi et el., 2013）第一阶段（细胞核内）① miRNA 基因由 RNA 聚合酶 II（RNase II）或 RNA 聚合酶 III（成具有 5’端帽子结构、3’端 Poly（A）尾的初级转录物（pri-mimiRNA 序列较长，长度从数百到数千 nt 不等，有的是单顺反子（单是多顺反子（多发卡结构）。pri-miRNA 进一步经 Drosha 酶剪切形环结构的 miRNA 前体（pre-miRNA），这一过程通常需要迪格奥区蛋白 8（Dgcr8)和双链 RNA 结合域蛋白的参与，有时还需要其它68/p53,KH 型剪切调控蛋白(KSRP)[9-11]。Drosha 酶是一种 RNA 内链 RNA 结合结构域、RNA 酶 III 结构域和功能待定的 N 末端，’端进行磷酸化、3’端加入羟基[12]。因此，pre-miRNA 3’端有典型构。②不经 Drosha 酶剪切，细胞核内的 mRNA 通过剪切体作用剪切下

示意图,作用机制,示意图,碱基配对

图 2 miRNA 作用机制示意图Figure2 Examples of miRNAmechanisms of action（Bizuayehu & Babiak, 2011）1.3.1 miRISC 与 mRNA 的相互作用机制miRNA 成熟体的 5’端 2-8 位高度保守，被称作种子序列（seed se子序列是不完全互补配对的主要决定因素。目前，miRNA-靶 mRNA 相模型有：Seed matching：种子序列与靶基因 mRNA 的 3’-UTR 碱基配对matching：靶基因 mRNA 的 3’-UTR 不包含相应 miRNA 的种子序列，仍能与其部分碱基互补[27]、Centered paired site：mRNA 与 miRNA 的中11-12 个连续碱基配对[28]、Pivot pairing and transitional nucleation modesites[29]。1.3.2 miRNA 的调控细胞中，miRNA 的调控机制严谨而复杂。miRNA 调控可以划分以下①转录水平上的调控 miRNA 所处的基因组位置上的启动子和miRNA 的转录。有些 miRNA 簇在一个基因簇中有多个启动子，如人类
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

【相似文献】