低温胁迫下极地鱼抗冻基因ld4对ZF4细胞应激颗粒形成的影响

发布时间：2020-06-10 14:09

【摘要】：在地球漫长演化进程中,气候环境不断变化,极地海域的水温逐渐从15℃变化到-1.9℃,导致许多极地鱼死亡,而有些极地海洋鱼类为了能够适应常年的低温,逐渐进化出了能够抵抗寒冷低温的机制,其中抗冻蛋白(AFP)的产生就是极地鱼的一种典型的适应性进化机制。Scholander和DeVries两位科学家在极地海洋中的一些鱼中首先发现有些鱼可以在零度以下的冷水中存活。后来,研究发现极地鱼类体内存在着一类能抵抗寒冷的蛋白,这一类蛋白质被称为AFPs。目前在鱼类中发现了5种抗冻蛋白,AFPⅠ、AFPⅡ、AFPⅢ、AFPⅣ和AFGPs,这几种AFPS之间的蛋白序列特征,空间结构以及进化来源等在不同的物种间有着巨大差异,其抗冻功能可能与其序列和结构特异性有关。抗冻蛋白的作用方式主要是通过抑制极地鱼体内冰晶的形成。南极鱼Lycodichthys dearborni(LD),体内含有丰富的AFPⅢ,本实验室从南极鱼的多聚AFPⅢ基因ld12 cDNA中克隆得到AFPⅢ蛋白四聚体,构建LD4质粒。低温胁迫会导致鱼类生理功能失调、机体损伤甚至死亡,细胞会产生各种适应性变化来应对这种低温胁迫,以有利于存活。在各种胁迫下,哺乳动物细胞和酵母细胞中发现了应激颗粒的产生。应激颗粒(Stress granules,SG)的产生是细胞的一种自我保护的防御机制,它是细胞在受到环境胁迫(如热休克、氧化性刺激、病毒感染等)时,抑制细胞内mRNA的翻译形成包含翻译起始因子、未翻译的mRNA和G3BP1,TIA-1等蛋白致密颗粒。这种颗粒已经在酵母、植物、哺乳动物细胞中得到证实。应激颗粒在低温胁迫下的研究主要集中于哺乳动物细胞模型,而其在鱼类细胞中鲜有报道。基于它们的功能相似性,实验室师姐研究ld4的功能时,在HeLa细胞中发现,低温胁迫下ld4的表达可以使细胞中应激颗粒的形成减少。这也就为我们在斑马鱼胚胎成纤维细胞(ZF4)中研究两者间的关系提供了基础。本实验将首先探究低温胁迫下ZF4细胞中的应激颗粒的形成。我们设置温度梯度18℃、13℃和10℃作为低温胁迫温度,低温处理不同时间后,利用细胞免疫荧光实验和RT-qPCR实验探究应激颗粒的形成以及应激恢复时SG的解聚情况。结果如下:1)ZF4细胞在低温胁迫下,与28℃下培养的细胞相比,无论是在18℃、13℃还是10℃低温处理下,通过免疫荧光实验发现不同温度的低温胁迫下,ZF4细胞会聚集形成应激颗粒,并且在10℃低温处理1h,13℃低温处理4h,18℃低温处理24h时,应激颗粒形成最明显。RT-qPCR实验也发现10℃低温处理1h,13℃低温处理4h,18℃低温处理24h时tial1、g3bp1的mRNA水平有显著性差异(p0.001)。RT-qPCR实验和细胞免疫荧光实验结果一致。随着胁迫温度的降低,应激颗粒的形成速度也在加快。2)ZF4细胞中应激颗粒的形成表现为应激颗粒数量增多和直径变大。3)在13℃低温处理4h后,进行应激恢复(28℃)时,应激颗粒会在短时间(十几分钟左右)迅速溶解。这种应激颗粒在胁迫消失后的快速解聚过程也与哺乳动物细胞类似。4)应激颗粒的解聚主要表现为应激颗粒的快速溶解消散。低温胁迫下,ZF4细胞中证实有应激颗粒形成。我们将ld4转染进ZF4细胞中,检测ld4成功表达的情况下应激颗粒的形成情况。结果如下:1)通过western blot实验,证明在ZF4细胞中ld4基因在蛋白水平都成功表达2)低温胁迫下,ld4基因的成功表达可以明显提高ZF4细胞的存活率。3)ZF4细胞免疫荧光和RT-qPCR实验表明,低温胁迫下,ld4的成功表达可以降低细胞中应激颗粒的产生。4)低温胁迫下,转染ld4重组质粒的ZF4细胞p-eIF2a和p53表达下降。以上研究结果表明,低温胁迫下ZF4细胞可以形成应激颗粒,并且胁迫消失应激颗粒也会迅速解聚。随着胁迫温度的降低,应激颗粒的形成速度也在加快。本文首次发现鱼类细胞在低温下形成应激颗粒,主要成分与哺乳动物细胞类似,表明应激颗粒是动物细胞应对低温刺激的普遍反应机制。低温胁迫下,发现LD4可以通过抑制翻译起始因子eIF2a的磷酸化使tial1、g3bp1水平下降,导致应激颗粒的形成减少。(应激颗粒作为细胞的保护性机制,那么应激颗粒的减少,会不会对细胞有什么不利影响呢,于是我们检测了与凋亡相关的p53的表达情况,发现低温在斑马鱼细胞中p53的表达量明显减少。说明应激颗粒的减少并没有对细胞存活率产生影响。)我们猜测可能LD4可能对应激颗粒的作用起到了一个补偿作用。本实验在低温胁迫下,关于LD4和应激颗粒的初步探究,期望可以为ZF4细胞低温下应激颗粒的研究提供理论支持,也希望可以为ld4基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供了理论依据。
【图文】：

上海海洋大学硕士学位论文檬形状[50]。中度活跃的 AFP 能够与棱镜或锥体平面结合[49, 51, 52]，而过度活P 能够与冰晶的基面结合[51, 53]。由 AFP 形成的冰形态是 AFP 与冰相结合的（图 1-3）。 TH 已被用于确定描述 AFP 的活性。对于大多数鱼类 AFP，观 TH 活性约为 1°C[54, 55]。在冬季（-1.9°C），这种温差为海水提供足够的缓冲地鱼在寒冷的环境中生存。除鱼类 AFP 外，许多海洋 AFP 与海冰有关[56-59地鱼类的血浆不同，海冰中盐水通道中的海水会冻结成冰。因此，来自海细菌，微藻类和真核原生生物的 AFP 被分泌到周围环境中，以保护自身不50, 56, 57]。

来，低温胁迫作为酵母细胞和哺乳动物细胞中产生 SG 的多人注意到。研究表明寒冷刺激诱导的SGs仅在低温数小时佳生长温度后几分钟内 SG 迅速溶解。这与热刺激或亚砷（SGs 大约在 15-30 分钟后出现，但在应激恢复时需要 30[6]。迫下哺乳动物细胞中的 PERK 激酶（蛋白激酶 R 样内质网化，致使 SG 形成。此外，寒冷刺激这种温度胁迫致使细胞胞的能量消耗受到影响，翻译速率降低，某些蛋白功能激胞损伤。在葡萄糖饥饿（缺少）的情况下，也发现翻译抑细胞存活率。有研究表明低温胁迫下 cos7（非洲绿猴肾成，促使 SG 形成，并且促进哺乳动物细胞在低温下的存活译抑制下产生的 SG 与翻译抑制下细胞存活之间存在什么楚，仍需要感兴趣的研究者进一步探究。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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