虾蟹螺原体免疫胶体金试纸条检测技术的研究

发布时间：2020-06-12 14:23

【摘要】：中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是一种新型水生动物病原,不仅是河蟹“颤抖病”的致病菌,也是引起克氏原螯虾、南美白对虾、罗氏沼虾和日本沼虾等水生甲壳动物重大疫病的致病菌,给养殖业带来巨大损失,引起了国内外同行的广泛关注和重视,而建立有效的疫病检测技术,对疫情的快速诊断和鉴定,尽快明确病原,开展有针对性的防治具有十分重要意义。本人所在课题组前期开展了水生动物螺原体的系列化研究,其中已经建立光镜、电镜、PCR、ELISA、培养等检测技术,然而这些技术(除ELISA外)都需要相关的仪器、设备和技术,无法在用于现场快速检测。而前期建立的ELISA快速检测技术,虽然可以用于生产实际的现场快速检测,但由于操作步骤较多,检测花费需要3小时,操作者还需要进行培训。因此,本硕士学位论文在前期研究的基础上,开展胶体金免疫层析检测方法的研究,为中华绒螯蟹螺原体的检测提供一种快速、简便和适应性广的方法,方便广大养殖户。本论文的研究结果主要包括以下2个方面:1、虾蟹螺原体多克隆抗体的制备本实验通过采用常规多抗制备方法制备多抗,四次免疫后一周取血的方案,摸索出制备该病原高效价多抗的最佳制备方法,利用传统间接ELISA方法进行效价检测,4倍梯度稀释到1:2097152,二抗稀释比例为按1:3000。而且还通过亲和力测定方法和使用sigmaplot软件进行数据模拟,得出亲和力常数。实验结果表明,所制备的螺原体多克隆抗体效价可达1:32768,并且纯化效果好、亲和力常数为4×108,这些实验结果都说明,本研究制备的抗体可以作为下一步实验的材料。2、虾蟹螺原体胶体金试纸条检测技术的研究采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金,以中华绒螯蟹螺原体多克隆抗体进行标记,利用双抗体夹心胶体金免疫层析法,以中华绒螯蟹螺原体多克隆抗体作为检测线捕获抗体,以羊抗兔二抗为质控线捕获抗体,初步建立了能检测中华绒螯蟹螺原体的胶体金试纸条。结果表明,制备的胶体金是40nm,最大吸收峰是522nm,用螺原体多抗标记的最佳pH是8,最佳标记浓度是15 μg/ml。选用0.01MpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)作为反应线多抗和羊抗兔IgG的稀释液,用于实验包被硝酸纤维素膜,所研制的胶体金试纸条敏感性为104CCU/ml,特异性高。该方法操作简便,敏感性高和特异性强,可用于现场大量样品的检测。
【图文】：

照片,免疫血清,血清

以螺原体蛋ＦＩ作为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，第四次免疫后收集抗逡逑血清，采用间接ＥＬＩＳＡ法检测抗血清的效价。采用倍比稀释法进行抗血清的测逡逑定，当所测样品的ＯＤ值与对照的比值大于２时，被判定为阳性。如图２．１所逡逑示，，此抗血清的效价在丨：３２７６８左右。逡逑通过肉眼观察酶标板上的显色情况可以看出随着稀释倍数的增加，颜色明显逡逑呈现梯度变化（图２．１），且ＯＤ４５０值随着稀释倍数的增加呈现出显著的递减趋势逡逑（表２．１）；而免疫前的健康兔血清（阴性对照）和空白对照则没有相应的梯度反逡逑应，说明通过免疫后得到的血清里确实含有了该抗原对应的抗体，而且已成功制逡逑备出多克隆抗体。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑图２．１免疫血清效价检测逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｓｅｒａ逡逑注：阴性对照和空白对照各有３个孔如照片所示，其他为倍比稀释抗血清，每个稀逡逑释度均为３个孔逡逑１６逡逑

照片,多克隆抗体

以螺原体蛋ＦＩ作为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗体，第四次免疫后收集抗逡逑血清，采用间接ＥＬＩＳＡ法检测抗血清的效价。采用倍比稀释法进行抗血清的测逡逑定，当所测样品的ＯＤ值与对照的比值大于２时，被判定为阳性。如图２．１所逡逑示，此抗血清的效价在丨：３２７６８左右。逡逑通过肉眼观察酶标板上的显色情况可以看出随着稀释倍数的增加，颜色明显逡逑呈现梯度变化（图２．１），且ＯＤ４５０值随着稀释倍数的增加呈现出显著的递减趋势逡逑（表２．１）；而免疫前的健康兔血清（阴性对照）和空白对照则没有相应的梯度反逡逑应，说明通过免疫后得到的血清里确实含有了该抗原对应的抗体，而且已成功制逡逑备出多克隆抗体。逡逑ｍｍ逡逑ｍ逡逑图２．１免疫血清效价检测逡逑Ｆｉｇ邋２．１邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｔｉｔｅｒ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｓｅｒａ逡逑注：阴性对照和空白对照各有３个孔如照片所示，其他为倍比稀释抗血清，每个稀逡逑释度均为３个孔逡逑１６逡逑
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945

【参考文献】