wt1a和wt1b在斑马鱼肾脏发育中的功能研究

发布时间：2020-06-13 10:50

【摘要】：WT1(Wilms’tumor suppressor gene 1)是一种编码锌指蛋白的转录因子,对哺乳动物泌尿生殖系统的发育有重要作用,哺乳类WT1基因突变会导致肾、性腺和脾等器官缺陷。在斑马鱼(Danio rerio)中存在两个WT1同源基因,分别命名为wt1a和wt1b。本实验采用CRISPR/Cas9技术在斑马鱼中分别敲除wt1a和wt1b来研究其对斑马鱼胚胎发育的作用。纯合的wt1a~(-/-)突变体后代表现出生长发育畸形,出现心包积液、卵黄囊水肿同时肾小球的发育也会受损;纯合的wt1b~(-/-)突变体表型正常、能正常存活,没有观察到类似于敲降wt1b时所出现的表型。足细胞是机体形成肾小球滤过屏障的重要部分,其缺失能引发多种肾脏相关的疾病。为进一步验证wt1a~(-/-)突变体发育畸形是否与肾脏足细胞发育相关,我们选取了足细胞标记基因podocin和nephrin,通过二者的表达量变化可知wt1a的缺失会阻断足细胞的分化并抑制podocin和nephrin的表达。然而podocin和nephrin在wt1b~(-/-)突变体中能正常表达。因此,wt1a在斑马鱼肾脏发育过程中发挥着重要作用而wt1b可能不是肾脏发育所必须的基因。细胞自噬(autophagy)是真核细胞中一种普遍而又重要的生命现象,在维持细胞稳态和细胞生命活动等方面起重要作用,自噬异常与细胞生长发育及多种疾病密切相关。检测发现在wt1a~(-/-)突变体中自噬水平明显降低,为进一步研究自噬、wt1a在足细胞发育中的功能,我们选取自噬激活药物雷帕霉素处理斑马鱼胚胎一段时间后检测足细胞标记基因的表达水平,发现足细胞的损伤得到了部分改善。综上所述,我们的实验确认了wt1a是斑马鱼肾脏发育所必须的基因,并且为建立鱼类足细胞损伤的研究模型提供了一条思路。
【图文】：

前肾,陈朝,斑马鱼,发育过程

远端早期（distal early, DE）和远端晚期（distal late, DL）、肾小球（glomerulus, G）、颈部（neck, N）、斯坦尼氏小体（corpuscle of Stannius, CS）和前肾导管（pronephricduct,PD）。每个节段都能表达特定相关的基因，通过这些 maker 基因可对不同节段进行区分。随着机体发育至 48hpf，各个节段的肾管随着机体细胞迁移完成前肾组织形态的发育，两侧的肾小球彼此靠拢并在尾部泄殖腔处融合，启动血液滤过，形成有功能的前肾（Wingert et al 2007; Wingert and Davidson 2008）。随着斑马鱼从胚胎到幼鱼的蜕变，大约 10dpf 开始投喂，这一发育过程中伴随着鳞和鳍的产生，脏器、神经系统的重塑（Parichy et al 2009）。大约是为适应更高的渗透压环境斑马鱼的中肾肾单位在受精后 12-14dpf 开始形成，早期中肾的发生包括在尾部的肾祖细胞的初现，这些细胞聚集成簇，，上皮细胞变成肾小泡状体，延伸至新的肾单位并与之融合，促进中肾形成，而前肾随之在 30-60dpf 退化（Zhou et al 2010; Diep et al 2011;Diep et al 2015）。中肾发育成熟后随着机体的不断发育会伴随着新的肾单位产生以适应体重变化和损伤修复的需要（Zhou et al 2010）。

斑马鱼,成鱼,抗体

图 3-1 斑马鱼成鱼各组织 RNA 的提取结果 The results of RNA extraction from various tissues of zlot 检测 wt1a 和 wt1b 在各组织中的表达鼠的 WT1 抗体（Anti-Wilms Tumor Protein ant在斑马鱼各组织中的表达情况，选用 β-actin 作为 45KD。由图 3-2 可知 WT1 主要在斑马鱼的
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】