大黄鱼溶菌酶对鳗弧菌胁迫的响应研究

发布时间：2020-06-13 18:39

【摘要】：大黄鱼(Larimichthys crocea),属于硬骨鱼纲鲈形目,是我国传统的“四大海产”之一。随着大黄鱼人工养殖日益兴起,高密度、集约化养殖模式加速了鱼体微生物病症的发生,出现了如鱼体生长衰退、抗病能力弱、品质低等问题,严重影响并制约了大黄鱼养殖业的健康持续发展。鳗弧菌是养殖大黄鱼出现弧菌病的主要病原菌之一,而溶菌酶是鱼体内杀菌的关键酶,本文以大黄鱼为研究对象,研究溶菌酶在大黄鱼不同组织表达情况,并通过鳗弧菌侵染和ploy(I:C)处理,研究溶菌酶基因的胁迫反应,希望可以为以后大黄鱼的免疫调节机制研究提供一定的理论支持。主要结论如下:通过大黄鱼基因组数据库获得大黄鱼两种溶菌酶CDNA全长序列,并通过克隆测序进行验证,c型溶菌酶CDNA全长为763bp,编码110个氨基酸,其基因组数据库登录号为XM-010753143.1;g型溶菌酶CDNA全长为879bp,编码193个氨基酸,其基因组数据库登录号为XM-010740410.1。鱼类c型溶菌酶与哺乳动物的亲缘关系较近,鱼类g型溶菌酶同鸟类亲缘关系较近。研究两种溶菌酶基因在大黄鱼脾脏、肾脏、肝脏、心脏、肌肉、鳃、肠、脑这8种组织表达特异性情况,表明c型溶菌酶在肝脏中的表达量最高,在心和肠中的表达量略高于其他组织;g型溶菌酶在肠和肾表达量最高,其次是腮和肝、脾。鳗弧菌侵染实验证明:在肝脏、脾脏、肾脏组织中,c型溶菌酶的表达量比对照组低,但鳗弧菌侵染6h后,肾脏中c型溶菌酶表达显著升高;g型溶菌酶的表达量呈先升高后降低趋势,在肝脏中,鳗弧菌处理下g型溶菌酶在12h表达量达到峰值;ploy(I:C)处理下在24h表达量达到峰值。在脾脏中实验组的表达量在36h达到峰值;在肾脏中,鳗弧菌和ploy(I:C)处理下g型溶菌酶分别在36h和48h表达量达到峰值。本文通过对大黄鱼两种溶菌酶基因的全长序列的生物信息学分析、组织特异性表达以及鳗弧菌侵染对上述两种溶菌酶基因表达量的影响这三方面的研究得出:1、c型和g型溶菌酶基因的保守性较高;2、健康大黄鱼中两种基因都在肠的表达量高,但效果不同;3、受到细菌侵染后肝脏、肾脏、脾脏中c型溶菌酶基因表达量变化不大,推测该溶菌酶可能主要发挥消化作用;g型溶菌酶基因在肝脏、肾脏、脾脏中表达量都有显著上调,只是最高表达量出现时间不同,说明g型溶菌酶参与了大黄鱼的机体免疫。
【图文】：

电泳图,脑组织,序列,电泳图

的氨基酸序列，它的网址为 http://ww件预测目的基因序列的等电点(pI)以及分rg/tools/protparam.html；使用 UCSC 在线进行搜索，它的在线网址为 http://geno酶 ORF 获得及序列分析结果据库中查到溶菌酶全长基因序列，通过序列，并进一步测序，通过同源性比对，阅读框序列全长。实验所用模板取自于脑条大黄鱼脑组织中总 RNA 提取的电泳

氨基酸序列,c型溶菌酶,氨基酸序列,序列

2.4.1.2 大黄鱼 c 型溶菌酶基因 ORF 的获得在大黄鱼全基因组数据库中获得 c 型溶菌酶序列全长，在 NCBI 上通过同源性比对发现其编码的蛋白与其他鱼类的溶菌酶序列具有相似的长度，其编码的蛋白也具有相同的保守结构域。以此序列为依据设计引物，，进行 PCR 扩增并测序，测序结果与数据库中一致。此基因在 GenBank 数据库的登录号为 XM-010753143.1。利用 ORFFinder 在线软件对其开放阅读框进行搜索，获得的 c 型溶菌酶基因 CDNA 序列全长为 763bp，5’非编码区 143 bp，3’非编码区长度为 287 bp，开放阅读框长度为 333 bp，可编码 110 个氨基酸。在线预测的 c 型溶菌酶多肽的相对分子质量(MW)约为27.68kDa，理论等电点(pI )为 5.24。开放阅读框具有八个保守的 Cys(半胱氨酸)，可形成 Cys4-Cys108，Cys12-Cys96，Cys46-Cys61，Cys57-Cys92 共四对二硫键。大黄鱼 c型溶菌酶有 2 个保守的催化残基位点 Glu(E17)和 Asp(D34)。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943

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