杂色鲍MyD88在发育和免疫过程中的作用研究

发布时间：2020-06-13 23:43

【摘要】：杂色鲍是我国重要的海产养殖贝类,鲍鱼养殖业在全球范围内具有重要地位。由于杂色鲍的疾病多发造成了鲍的大规模死亡,因此研究杂色鲍的发育和免疫的机理至关重要。MyD88是经典信号通路—TLR信号通路中重要的一员,可以激活NF-κB和凋亡信号通路,在免疫机制上具有重要的作用。同时,MyD88是Toll-背腹分化通路中的重要一员,这对研究杂色鲍发育的机制具有重要的意义。在本实验室获得的杂色鲍转录组基础上,采用RACE技术共成功克隆得到两条骨髓样分化因子序列分别命名为hdMyD88和hdMyD88-2。本实验结合qPCR、RNAi和原位杂交技术研究杂色鲍MyD88在免疫和发育中的作用。主要的结果有:1)hdMyd88 cDNA全长为1927 bp,3’UTR为483bp,5’UTR为130 bp,开放阅读框1314 bp,编码438个氨基酸,距polyA 20 bp处有加尾信号。生物信息学分析表明其编码蛋白,含有Myd88 DD结构域(215-460 bp)和TIR-2超家族结构域(665-1000 bp),DD结构域中包含有Myd88-IRAK4的相互作用位点。预测的蛋白分子量约48.92 kDa,等电点约5.63。不含信号肽,无二硫键,1个N糖基化位点,46个丝氨酸磷酸化位点,6个苏氨酸,5个酪氨酸,无跨膜结构。hdMyd88-2 cDNA全长为1820 bp,3’UTR为580bp,5’UTR为190 bp,开放阅读框1050 bp,编码350个氨基酸,距polyA 15 bp处有加尾信号AATAA。含有Myd88 DD结构域(247-475 aa)和TIR 2超家族结构域(823-1228 bp)。预测的蛋白分子量约39.65 kDa,等电点约8.05。不含信号肽,无二硫键,4个N糖基化位点,14个丝氨酸磷酸化位点,7个苏氨酸,2个酪氨酸,无跨膜结构。2)在胚胎和幼虫发育过程中,hdMyD88从卵、2细胞、8细胞到桑葚胚时期表达量比较稳定,而8细胞较2细胞相比呈显著性上升(p0.05);从128细胞开始MyD88的表达量逐渐下降;从桑椹期直至面盘幼虫晚期,MyD88的表达量都处于较低水平,并与8细胞和匍匐幼虫早期存在极显著差异(p0.01)。IRAK4在卵和2细胞时期表达量比较稳定,8细胞期的表达量急剧上升,之后的表达量急剧下降,随后的表达量较为稳定。8细胞期的表达量与其他各时期呈显著性差异(p0.05)。AP1在卵裂、胚胎发育阶段以及幼虫阶段早期早期的表达量比较稳定,从匍匐幼虫早期后,表达量显著性上升(p0.05)。TNFα的表达量从卵细胞到128细胞逐渐下降,但没有显著性差异(p0.05);随后表达量逐渐上升,到匍匐幼虫早期时,TNFα的表达量与二细胞和8细胞的表达量呈显著性差异(p0.05)。CAT的表达量从卵细胞到面盘中期一直处于较为稳定的状态,匍匐幼虫早期的表达量显著性上升(p0.05)。SOD的表达情况同CAT的较为相似,匍匐幼虫早期与其他各时期的表达量相比呈显著性上升(p0.05)。与MyD88不同的是,MyD88-2的表达量从卵细胞开始处于较低的表达水平,直到担轮幼虫期显著性上升(p0.05),之后在面盘期下降,直至匍匐幼虫早期表又显著性上升(p0.05)。3)dsMyD88浸泡担轮幼虫后结果显示:dsMyD88处理后对空白对照组、阴性对照组dsEGFP和dsMyD88实验组的幼虫存活率无显著差异(P0.05)。结果显示:基于不同的内参,dsMyD88组处理后的担轮幼虫的MyD88的表达量明显下降,与空白组和阴性对照组存在显著性差异(P0.05)。同时,对于Toll信号通路中Myd88的的下游基因IRAK4的表达量也明显下降(P0.05);AP1的表达量显著性上升(P0.05),TNFα的表达量极显著性上升(P0.01),CAT的表达量也明显下降(P0.05),而SOD的表达量不存在显著性差异(P0.05)。对于MyD88,MyD88-2的表达量较空白组显著性降低(P0.05)。dsMyd88浸泡面盘早期幼虫后结果显示;dsMyD88组处理后的面盘早期幼虫的MyD88的表达量明显下降,与空白组和阴性对照组存在极显著性差异(P0.01)。同时,对于Toll信号通路中MyD88的的下游基因IRAK4的表达量空白组同干扰组表达量较明显下降(P0.05),对于AP1和TNFα,AP1和TNFα的表达量都呈极显著性上升(P0.01);CAT的表达量不存在也显著性差异(P0.05),而SOD的表达量较其他两组呈存在显著性差异(P0.05);对于MyD88-2来说,各组之间都不存在显著性差异。4)采用原位杂交的方法检测dsMyD88处理担轮幼体早期和面盘幼虫6 h前后的样品,显示从担轮幼体早期到面盘中期,MyD88特异性定位在腹侧。RNAi干扰后,实验组未检测到阳性信号,而阴性对照组具有阳性信号。RNAi干扰后再用副溶血弧菌感染幼虫,可以检测到微弱的信号。5)优化了培养杂色鲍原代细胞条件,并利用这些原代细胞进行了RNAi和外源基因表达。结果表明,较高的渗透压对血淋巴细胞培养起重要作用,淋巴细胞分离液分离血淋巴细胞更利于其生长。原代细胞培养至5 d时,在细胞培养液中添加10μg/mL的MyD88dsRNA,能够显著降低MyD88 mRNA的表达。pEGFP-N1转染培养5 d的鳃细胞,5 d后可以检测到绿色荧光。以上结果表明,可以成功培养杂色鲍血、鳃原代细胞,并且这些原代细胞可以进行基因功能缺失或调高的研究,为功能基因注释提供了便利条件。 【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4

【图文】：

结构域,保守性

集美大学硕士学位论文杂色鲍 MyD88 在发育和免疫过程中的作用研究基酸和表示疏水氨基酸残基，图 1.1[43]）。MyD88N 端编码一个大约 90 个氨基酸的死亡结构域（DD），，最初发现这个结构域的作用是促凋亡蛋白；后来发现的一些含有 DD 结构域的蛋白质确没有明显的凋亡作用，这说明 DDs 似乎是一般蛋白相互结合为点的基序[44]。多数蛋白质中，DDs 通常位于非常靠近 5 端，DD 通常折叠成含有 3 个螺旋。这个 DD结构域通常与和 caspase 的招募结构域（CARD）和死亡效应结构域家族（DED）构成 DD超家族[45]。类似性地，TIR 结构域（残基 155-296）和 DD（残基 1-109）使 MyD88 作为接头分子将信号在上下游之间传递，如 IRAK TLR/IL-1R。此外，MyD88 可以通过 TIR-TIR和 DD-DD 的相互作用[46, 47]。早期的报告指出，MyD88 基因的表达仅限于髓组织。随后研究表明，MyD88 在非骨髓组织中也表达，表明 MyD88 存在着更广泛的生物学功能[39]。

杂色鲍,琼脂糖凝胶电泳,粘液腺,外套膜

色鲍各组织总 RNA 琼脂糖凝ectrophoresis of total RNA in tiss肌肉；2：外套膜；3：粘液腺；antle; 3, colleterial gland; 4, hep果NA 为模板，RACE 引物分 hdMyD88 3’ 端扩增产物，34 bp；图 3-4 为杂色鲍 hdM

【参考文献】