【摘要】：本文以珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatu♂)为研究对象,通过研究不同植物蛋白源对珍珠龙胆石斑鱼生长性能,酶活性,肠道炎症相关抗炎因子、致炎因子mRNA表达量,以及肠道PI_3K/Akt蛋白表达的影响,探讨由TLRs/MyD88-PI_3K/Akt信号通路调控珍珠龙胆石斑鱼生长性能、酶活性、相关基因和蛋白表达的影响。本文的研究内容及主要研究结果如下:1、设置饲料鱼粉含量60%为对照组(FM),并利用浓缩棉籽蛋白(Cottonseed protein concentrate,CPC)分别替代对照组中12%、24%、36%、48%和60%(R12、R24、R36、R48和R60)鱼粉蛋白,配制成6种等氮等脂的实验饲料,同时在替代组中添加蛋氨酸(Met)和赖氨酸(Lys)至对照组水平,通过探究珍珠龙胆石斑鱼生长性能、酶活性、肠道菌群以及肠道TLRs/MyD88的变化,寻求CPC在珍珠龙胆石斑鱼饲料中的最适替代水平。挑选初重为(11.00±0.23)g的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼,随机分成6组,每组设置3个重复,每个0.5m~3玻璃钢桶中养殖30尾,进行8周的养殖实验。养殖实验结束后,每桶随机挑选10尾鱼,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行为期一周的攻毒实验。结果表明:当替代水平达到48%时,特定生长率(SGR)显著性最高(P0.05),替代水平为24%时,饲料系数(FCR)显着增加(P0.05)。当替代水平达到36%时,血清中丙二醛(MDA)含量显着增加(P0.05)。前肠,中肠和后肠皱褶高度在替代水平达到48%时显着降低(P0.05)。当替代水平达到36%时,肝脏脂肪沉积加重。通过illumina高通量测序技术测定肠道菌群组成,从科水平上分析,当替代水平上升时,PI中肠炎致病菌,如支原体科(Mycoplasmataceae),丰度上升,同时从毛单胞菌科(Comamonadaceae),乳杆菌科(Lactobacillaceae)等对肠道有益菌丰度下降;MI中乳杆菌科丰度降低;弧菌科(Vibrionaceae)丰度上升;DI中产碱菌科(Alcaligenaceae)和黄单胞菌科(Xanthomonadaceae)丰度降低。当替代水平达到60%时,前中肠菌群丰度已经失调,不存在优势菌,后肠替代到24%时,就已经丧失了优势菌,发生了严重的菌群失调。前肠、中肠和后肠中IL-6,TNF-α和IL-1βmRNA的表达均显着上调(P0.05),hepcidin mRNA表达均显着下调(P0.05)。在PI和MI中,IFN-γmRNA表达显着上调(P0.05)。前肠P-PI_3K/PI_3K,P-Akt/Akt和中肠P-PI_3K/PI_3K蛋白表达均随着替代水平的升高显著上调(P0.05),中肠P-Akt/Akt和后肠P-Akt/Akt在替代水平达到60%时显著上调(P0.05)。以上结果表明,CPC替代鱼粉后降低了珍珠龙胆石斑鱼的生长性能和肠道免疫性能。前肠、中肠和后肠有益菌丰度降低,有害菌丰度上升。同时PI,MI和DI中的不同炎症功能反应部分地由TLR-2/MyD88-PI_3K/Akt信号传导途径介导。以SGR为判据,CPC在珍珠龙胆饲料中最佳替代水平和最大替代水平分别为17.18%和34.36%。2、设置饲料鱼粉含量60%为对照组(fishmeal,FM),并分别利用豆粕(soybean meal,SBM)、花生粕(peanut meal,PM)、普通棉籽蛋白(cottonseed meal,CSM)和浓缩棉籽蛋白(CPC)替代对照组中45%鱼粉蛋白,配制成5种等氮等脂的实验饲料。通过探究珍珠龙胆石斑鱼生长性能、酶活性、肠道TLRs/MyD88以及PI_3K/Akt信号通路的变化,寻求不同植物蛋白源作用机制的差异。挑选初重为(11.00±0.23)g的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼,随机分成5组,每组设置3个重复,每个0.5m~3玻璃钢桶中养殖40尾,进行8周的养殖实验。结果表明:FM组SGR显著高于SBM、PM、CSM和CPC组(P0.05),而CPC组SGR显著高于SBM、PM和CSM组(P0.05)。SBM、PM、CSM和CPC组血清CAT含量显著高于FM组(P0.05)。SBM组、PM组和CSM组的前肠、中肠和后肠肠道直径/皱襞高度比(Id/Ph)均显著低于FM组和CPC组(P0.05),而CPC组显著低于FM组(P0.05)。与SBM、PM和CSM组相比,MI中CPC组中红杆菌科(Rhodobacteraceae)和微杆菌科(Microbacteriaceae)丰度上升,DI中毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)丰度降低。与FM组相比,SBM,PM和CSM组TNF-α,IFN-γ和IL-12 mRNA表达量显著上调(P0.05),而CPC组显著低于SBM,PM和CSM组(P0.05)。PI和MI的IL-6、MI的hepcidin、TLR-3以及DI中的TLR-3 mRNA表达均显著低于FM组(P0.05)。在PI、MI和DI中,SBM组和PM组P-PI_3K/PI_3K蛋白表达均显著高于FM组(P0.05),PM和CSM组P-Akt/Akt蛋白表达均显著高于FM组(P0.05)。以上结果表明,SBM、PM、CSM、CPC均能显著降低珍珠龙胆石斑鱼生长性能和抗氧化能力,破坏PI、MI、DI形态结构,造成PI、MI、DI肠道菌群紊乱。另一方面,植物蛋白源通过部分激活PI,MI和DI中TLR-2/MyD88-PI_3K/Akt信号通路,引起肠道炎症。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S965.334
【图文】：
图 2-1 浓缩棉籽蛋白替代鱼粉对珍珠龙胆肝脏脂肪沉积的影响（油红 O 染色，×10）Fig.2-1 The effect of CPC replacing fishmeal on liver fat deposition ofEpinephelus fuscoguttatus ×E. lanceolatu (oil red O staining, ×10)图 2-2 浓缩棉籽蛋白替代鱼粉水平与珍珠龙胆 SGR 的二次回归曲线Fig.2-2 The relationship between dietary CPC replacement level and SGR ofEpinephelus fuscoguttatus ×E. lanceolatu
图 2-1 浓缩棉籽蛋白替代鱼粉对珍珠龙胆肝脏脂肪沉积的影响（油红 O 染色，×10）Fig.2-1 The effect of CPC replacing fishmeal on liver fat deposition ofEpinephelus fuscoguttatus ×E. lanceolatu (oil red O staining, ×10)
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2712253
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