大鲵UCHL1和ESR1分子特性及其在雄性性腺中的表达定位研究
发布时间：2020-06-15 09:53
【摘要】：大鲵是目前现存最大的两栖类,但是由于过度开采,栖息地的丧失,环境的污染,野生大鲵数量急剧下降。大鲵生殖生物学研究对于人工繁育及大鲵资源保护具有重要意义。首先通过解剖学及组织学分析了大鲵雄性性腺发育,其次克隆大鲵UCHL1及ESR1基因、生物信息学分析了二者分子特性;最后通过RT-PCR和RT-qPCR及免疫组织化学方法研究了UCHL1及ESR1在性腺发育过程中的表达和定位,结果如下:1、解剖观察发现,6月龄大鲵性腺呈长条状;12月龄到性成熟前,大鲵睾丸呈长椭圆形、卵巢呈扁平弯曲带状;初步确定大鲵性别分化的时间在6月龄到12月龄之间。H.E.染色结果,6月龄大鲵性腺有大核细胞形成的外壁,中央为单细胞构成的网状腔体;12月龄大鲵睾丸精小叶开始形成,间质组织丰富;在2龄大鲵睾丸精小叶中生殖细胞和体细胞形成生精上皮,精小叶腔出现;3龄大鲵睾丸精小叶数目增多,精小叶腔增大;成年大鲵在繁殖间期,睾丸精小叶中,各级生殖细胞有规律分布,且精小叶顶部出现成熟的精子;繁殖期的睾丸精小叶充满成熟的精子。2、大鲵UCHL1基因全长1087bp,ORF有669 bp,编码222个氨基酸;大鲵UCHL1蛋白有1个O-糖基化位点,14个磷酸化位点;大鲵UCHL1蛋白与人类UCHL1蛋白的同源性最高,达到73.99%。RT-qPCR结果显示,随着雄性性腺的发育,UCHL1 mRNA表达水平在2龄时达到峰值;进一步检测显示繁殖期的UCHL1 mRNA表达显著低于繁殖间期的水平。免疫组织化学表明,在6月龄大鲵性腺中,UCHL1表达于靠近性腺周边的大细胞核中,随着大鲵睾丸的发育,在12月龄大鲵睾丸中,UCHL1定位于精小叶包围的细胞质;在2龄到3龄大鲵睾丸中,UCHL1定位于靠近小叶腔的细胞质和细胞膜中,在成年大鲵睾丸中,UCHL1蛋白分布于精小叶腔内的细胞之间。3、大鲵ESR1基因全长2585bp,ORF有1755bp,编码584个氨基酸;大鲵ESR1蛋白有10个O-糖基化位点,3个N-糖基化位点,59个磷酸化位点;大鲵ESR1蛋白与日本大鲵的ESR1蛋白的同源性最高,达到99%,与哺乳动物同源性70%左右。RT-qPCR结果表明,从12月龄到3龄大鲵睾丸,ESR1mRNA表达呈上升趋势。免疫组化结果显示,在不同发育阶段的大鲵睾丸中,ESR1蛋白均定位在睾丸生殖细胞及间质细胞,成年期的成熟精子没有ESR1表达定位。以上结果表明,初步确定大鲵性别分化时间在6月龄到12月龄之间;在大鲵雄性性腺中,UCHL1有组成型表达(细胞核、细胞质和细胞膜定位)和分泌型表达(将生殖细胞分隔在不同微环境中),UCHL1可能与大鲵睾丸的发育有关,保证生殖细胞同步发育;ESR1在脊椎动物中是高度保守的,在大鲵睾丸中,ESR1蛋白均定位于生殖细胞及间质细胞,可能参与维持大鲵生殖细胞的生存及正常的精子发生。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：
（7）脱水：切片从 70%酒精、80%酒精、90%酒精到 100%酒精，每个浸泡 10 s，在纯二甲苯溶液中浸泡 1 min；（8）封片：组织切片在通风橱中晾到半干后，用塑料吸管吸一小滴中性树胶， 滴在组织的附近的切片上，平方盖玻片，均匀压片，组织要全部被树胶覆盖。2.2 实验结果2.2.1 大鲵雌雄鉴别（1）解剖学研究对来源于陕西省汉中市宁强县大鲵繁育场不同发育阶段（6 月龄、12 月龄、2 龄、3龄）雌雄正常健康大鲵，进行解剖，观察大鲵性腺，6 月龄（30 条）、12 月龄大鲵（20条）在体视镜下解剖，各发育阶段大鲵及大鲵性腺解剖如图 2-1。
2-1 D1、E1）体长约为 40cm 左右。在体视镜下解剖 30 条 6 月龄大鲵，大鲵性腺解剖结果相似（图 2-1 A2），均呈透明的长条状；12 月龄及 2 龄大鲵性腺解剖图，可以观察到两种不同的类型，睾丸和巢结构差异明显，12 月龄大鲵卵巢（图 2-1 B2）主要呈扁平弯曲带状，而且像有木耳样的边，在体内一般左右对称，而 2 龄大鲵睾丸（图 2-1C2）呈现出细长椭圆结构，眼很难观察到睾丸上的纵沟等结构，但是在体视镜下可以明显地观察到睾丸上的纵沟3 龄大鲵性腺解剖图（图 2-1D2，E2），可观察到两种类型性腺，3 龄大鲵睾丸（图 2-1D形态稳定，呈长椭圆形，前端比较尖，后端较钝，且不在同一个水平面上，有显著的沟，左右各 1 个，一般不是很对称，位于体腔背部，构成睾丸系膜连于背侧的体壁，肾脏平行，睾丸上的纵沟则把睾丸分为两叶；3 龄大鲵卵巢（图 2-1E2）形态与 12 月龄2 龄大鲵卵巢形态类似，呈扁平带状，弯曲而且像有木耳一样的边，在体内一般左右称。此外，在两侧睾丸的前端可以清晰可见黄色月牙状或指状结构，此结构为脂肪体（2-1D2）中黑色箭所示。（2）组织学分析
本文编号：2714246
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：
（7）脱水：切片从 70%酒精、80%酒精、90%酒精到 100%酒精，每个浸泡 10 s，在纯二甲苯溶液中浸泡 1 min；（8）封片：组织切片在通风橱中晾到半干后，用塑料吸管吸一小滴中性树胶， 滴在组织的附近的切片上，平方盖玻片，均匀压片，组织要全部被树胶覆盖。2.2 实验结果2.2.1 大鲵雌雄鉴别（1）解剖学研究对来源于陕西省汉中市宁强县大鲵繁育场不同发育阶段（6 月龄、12 月龄、2 龄、3龄）雌雄正常健康大鲵，进行解剖，观察大鲵性腺，6 月龄（30 条）、12 月龄大鲵（20条）在体视镜下解剖，各发育阶段大鲵及大鲵性腺解剖如图 2-1。
2-1 D1、E1）体长约为 40cm 左右。在体视镜下解剖 30 条 6 月龄大鲵，大鲵性腺解剖结果相似（图 2-1 A2），均呈透明的长条状；12 月龄及 2 龄大鲵性腺解剖图，可以观察到两种不同的类型，睾丸和巢结构差异明显，12 月龄大鲵卵巢（图 2-1 B2）主要呈扁平弯曲带状，而且像有木耳样的边，在体内一般左右对称，而 2 龄大鲵睾丸（图 2-1C2）呈现出细长椭圆结构，眼很难观察到睾丸上的纵沟等结构，但是在体视镜下可以明显地观察到睾丸上的纵沟3 龄大鲵性腺解剖图（图 2-1D2，E2），可观察到两种类型性腺，3 龄大鲵睾丸（图 2-1D形态稳定，呈长椭圆形，前端比较尖，后端较钝，且不在同一个水平面上，有显著的沟，左右各 1 个，一般不是很对称，位于体腔背部，构成睾丸系膜连于背侧的体壁，肾脏平行，睾丸上的纵沟则把睾丸分为两叶；3 龄大鲵卵巢（图 2-1E2）形态与 12 月龄2 龄大鲵卵巢形态类似，呈扁平带状，弯曲而且像有木耳一样的边，在体内一般左右称。此外，在两侧睾丸的前端可以清晰可见黄色月牙状或指状结构，此结构为脂肪体（2-1D2）中黑色箭所示。（2）组织学分析
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