蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术开发

发布时间：2020-06-17 10:26

【摘要】：蛙类养殖业可以满足人类食用、药用等需求,但是,一些疾病的爆发常使得蛙类养殖户遭受巨大的损失。当蛙类在养殖过程中爆发疾病的时候,常见多为细菌性疾病,传统的研究方法一般是,首先调查病原体,从病蛙的体内分离并纯化得到细菌,然后通过一系列生理生化和分子手段去鉴定细菌,接着通过回归感染实验验证病原菌,最后通过药敏试验,提出治疗药物的选择建议。这一过程,往往周期比较长,并且此时许多蛙患病程度已经很严重。本研究从致病菌的角度入手,以最常见的气单胞菌属(Aeromonas)蛙类致病菌(嗜水气单孢菌(A.hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、维氏气单胞菌(A.veronii))作为研究重点,利用环境DNA技术和多重PCR,建立蛙类养殖中常见气单胞菌属致病菌的检测技术,并试图从属的水平上提供用药参考,以期为蛙类细菌性疾病早期防治工作提供新思路及理论基础。本文的主要研究结果如下:1、建立了一种提取水体环境DNA的方法。采用滤膜法和沉淀法对两个不同大小的水域进行环境DNA提取,并比较了所得环境DNA的产量和质量,以此建立了一种高效实用的水环境DNA提取方法,可以适用于条件不同的水体。2、通过比较4种气单胞菌属常见致病菌及其他14个非气单胞菌的蛙类致病菌属16S rDNA序列,筛选出了2对可以用于气单胞菌属蛙类常见致病菌PCR扩增的特异性引物,PCR扩增产物大小分别为229bp和688bp,并且还可以结合环境DNA技术对水体进行气单孢菌属蛙类常见致病菌检测。3、通过比较嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌gyrB基因序列,设计筛选出4对可以用于鉴定这4种气单胞菌的特异性引物,其中,用于鉴定嗜水气单孢菌的引物PCR扩增产物大小为266bp;用于鉴定温和气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为99bp;用于鉴定豚鼠气单胞菌的引物PCR扩增产物大小为518bp;用于鉴定维氏气单胞菌的引物PCR产物大小为120bp。并利用多重PCR技术,建立了嗜水气单孢菌/维氏气单胞菌的双重PCR以及温和气单胞菌/豚鼠气单胞菌的双重PCR,可以用于这四种气单胞菌快速检测。4、根据文献筛选出的10种抗菌药物,由此对嗜水气单孢菌、温和气单胞菌、豚鼠气单胞菌和维氏气单胞菌这4种气单胞菌属常见致病菌进行药敏试验。结果发现这10种抗菌药物的对气单胞菌属蛙类常见致病菌的抑菌效果都很好。
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943
【图文】：

图 2.1 不同水样处理方法和不同样本量下各组 eDNA 的琼脂糖凝胶电泳图.1 The results of eDNA from different handle methods of water samples and different samrker DL2000，DNA 分子量标准自上而下为 2000 bp,1000 bp,750 bp,500 bp,250 bp,1

21图 2.2 各组 eDNA 经细菌 16S rDNA PCR 扩增后琼脂糖凝胶电泳检测图Fig. 2.2 The results of eDNA which amplified by bacterial 16S rDNA

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本文编号：2717474