三疣梭子蟹补体样分子结构及免疫功能研究

发布时间：2020-06-19 19:08

【摘要】：补体系统是先天免疫的重要组成部分和免疫效应系统,在无脊椎动物免疫防御反应中发挥重要作用。目前,对甲壳动物特别是蟹类补体系统的研究尚处于起步阶段,亟待深入研究。本论文利用基因克隆、实时定量PCR、原核重组表达、RNA干扰等分子生物学技术,对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的C1q受体(PtgC1qR)、α2-巨球蛋白(PtA2M-1和PtA2M-2)、含硫酯蛋白(PtTEP)和甘露糖结合凝集素(PtMBL)等补体样分子进行了结构和免疫功能的研究,探讨了补体样分子之间的作用关系以及它们在三疣梭子蟹免疫系统中的作用。补体C1q受体gC1qR是一种多功能、多配体的结合蛋白。三疣梭子蟹的PtgC1qR编码含有268个氨基酸残基的蛋白,该预测的蛋白含有1个保守的MAM33结构域,且其前56个氨基酸为线粒体靶序列。PtgC1qR基因在所有检测的组织中均有表达,且在肝胰腺中表达丰度最高。PtgC1qR在受精卵和卵裂期的表达水平显著高于囊胚期、原肠期和心跳期,暗示PtgC1qR可能是一种母源免疫基因。病原微生物刺激后,PtgC1qR在血细胞中的表达呈现时间依赖性响应模式。此外,PtgC1qR重组蛋白(rPtgC1qR)可与革兰氏阳性菌(藤黄微球菌Micrococcus luteus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)和革兰氏阴性菌(溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa)紧密结合,并显著抑制其生长,暗示PtgC1qR在三疣梭子蟹免疫防御和免疫识别中扮演重要角色;然而rPtgC1qR对真菌(毕赤酵母菌Pichia pastoris)的结合活力较弱且未表现出抑菌活力。酚氧化酶实验结果表明,rPtgC1qR可在体外以剂量依赖方式抑制酚氧化酶活力,且在蛋白浓度为11.65μM时几乎100%抑制酚氧化酶活力。RNAi结果表明,沉默PtgC1qR基因后,丝氨酸蛋白酶相关基因(PtcSP1-3、PtSPH),酚氧化酶原激活相关基因(PtproPO、PtPPAF)和C3样基因(PtA2M-1and PtTEP)的表达显著升高;然而吞噬作用相关基因(PtMyosin、PtRab5和PtArp)和PtA2M-2的表达量显著降低。α2-巨球蛋白(alpha-2 macroglobulin,A2M)是一种广泛存在的蛋白酶抑制剂。本研究克隆获得2条A2M基因,分别命名为PtA2M-1和PtA2M-2。PtA2M-1和PtA2M-2蛋白分别含有1,541和1,516个氨基酸,均包含A2M典型的结构域。节肢动物的A2M主要在血细胞中高表达,PtA2M-1和PtA2M-2在鳃、眼柄和消化道中表达量较高,而它们在血细胞中表达量很低。在胚胎发育过程中,PtA2Ms在受精卵中表达量最高,暗示它们可能是母源基因。感染溶藻弧菌后,PtA2M-1和PtA2M-2呈相似的时间依赖性响应模式。与PtA2M-2基因相比,PtA2M-1对藤黄微球菌和毕赤酵母菌的刺激更为敏感。沉默PtA2M-1或PtA2M-2基因可显著增强酚氧化酶原激活相关基因(PtproPO和PtPPAF)和丝氨酸蛋白酶相关基因(PtcSP1-3和PtSPH)的表达,然而PtLSZ和吞噬作用相关基因(PtMyosin和PtRab5)表达显著被抑制。PtA2M-1或PtA2M-2基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴中酚氧化酶和溶菌酶活力变化也支撑上述结果。此外,研究发现PtA2Ms可能通过Toll和NF-kB通路调控抗菌肽基因(PtALF1-3、PtCrustin1和PtCrustin3)的表达。含硫酯蛋白(thioester-containing proteins,TEPs)是一类在进化上古老的分泌型效应蛋白。三疣梭子蟹PtTEP的开放阅读框为4,434 bp,编码一个含有1,478个氨基酸残基的多肽,该肽链具有昆虫TEP蛋白保守的序列特征。PtTEP在肝胰腺、肠、鳃等主要免疫组织中高表达,在受到细菌或真菌诱导后表达量显著升高。与受精卵时期相比,PtTEP的转录产物呈先下降后显著升高的变化趋势。利用RNA干扰技术沉默PtTEP基因后,酚氧化酶原激活相关基因(PtproPO和PtPPAF)和丝氨酸蛋白酶相关基因(PtcSP1-3和PtSPH)均显著上调,而PtLSZ和吞噬作用相关基因(PtMyosin和PtRab5)的表达显著受到抑制。PtTEP基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴酚氧化酶和溶菌酶活力的变化也支持上述结果。此外,PtTEP基因沉默后抗菌肽基因和参与Toll和NF-κB通路激活的基因表达量均显著下降,这使得三疣梭子蟹更容易感染溶藻弧菌而死亡。甘露糖结合凝集素(mannose-binding lectin,MBL)作为一种重要的模式识别受体,参与补体凝集素途径的激活。本研究自三疣梭子蟹中克隆获得一个新型MBL分子(PtMBL)。PtMBL的cDNA全长为994 bp,包含一个777-bp的ORF,可编码含有259个氨基酸残基的蛋白,该蛋白具有保守的糖识别结构域(carbohydrate-recognition domain,CRD),在CRD区域中含有一个QPD序列。PtMBL在肌肉、肠、胃和肝胰腺等主要免疫组织中高表达,且PtMBL的mRNAs在感染细菌或真菌的早期均显著上调。随着胚胎的发育,PtMBL的转录产物呈现显著下降趋势,并在发育至心跳期时达到最低值,结合该基因在卵巢中显著高表达,提示PtMBL是一种母源免疫因子。沉默PtMBL基因可显著提高PtTEP、酚氧化酶原激活相关基因(PtproPO和PtPPAF)和丝氨酸蛋白酶相关基因(PtcSP1-3和PtSPH)的表达,然而PtA2Ms和吞噬作用相关基因(PtArp、PtMyosin和PtRab5)的表达显著被抑制。与对照组相比,PtMBL基因沉默的三疣梭子蟹血淋巴中PO活力显著升高。此外,沉默PtMBL基因,抗菌肽基因和参与Toll和NF-κB通路激活的关键基因的表达均显著上调。对三疣梭子蟹补体样分子的研究表明,它们与脊椎动物补体分子在结构上和免疫功能上均存在较高的相似性。研究认为,PtgC1qR和PtMBL作为模式识别受体,可通过调控下游C3样分子(PtA2M-1、PtA2M-2和PtTEP)激活原始的补体通路,三疣梭子蟹中原始的补体通路可通过调控丝氨酸蛋白酶级联反应、酚氧化酶原激活系统、吞噬作用以及Toll和NF-κB免疫通路介导的抗菌肽合成与分泌执行其免疫功能。同时,补体样分子也可以作为母源性效应分子参与对病原的免疫防御反应。综上,本研究结果表明补体样分子在三疣梭子蟹的先天免疫防御中具有重要作用,为进一步阐明无脊椎动物补体系统的进化以及系统地研究原始补体系统的功能提供了新思路和理论支撑。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

示意图,甲壳动物,免疫系统,示意图

三疣梭子蟹补体样分子结构及免疫功能研究吞噬作用是多细胞动物中最古老、最基本地抵御病原入侵的防卫机制之一。甲壳动物的成熟血细胞可将自身坏死细胞、细胞碎片以及异源微生物吞入胞内，随后利用胞内的活性氧、溶酶体的酸性或碱性磷酸酶等将这些非己物质溶解、消化和清除。当病原或异物颗粒较大，单个血细胞无法吞入时，甲壳动物便采取多细胞协作防御机制，也就是包被作用。在包被作用过程中，颗粒细胞和半颗粒细胞释放颗粒后与周围细胞相互连接形成包囊（Wertheim 等., 2005）。包被过程经常伴有丝氨酸蛋白酶级联反应中间物和黑色素的毒性作用，这便形成了消灭和清除入侵病原的综合防御机制（Dubovskiy 等., 2008）。然而，当入侵的病原数目过多时，甲壳动物血细胞内的黏附蛋白或整合素，可快速、有效地将固定病原形成结节，防止其进一步扩散，随后通过酚氧化酶级联反应使结节发生黑化作用，从而大规模杀灭病原微生物。

信号转导通路,果蝇,体液免疫,细胞免疫

图 1.2 果蝇中由 PRRs 介导的免疫信号转导通路（Lemaitre 和 Hoffmann, 2007）Figure 1.2 PRRs mediated signal transduction pathways in Drosophila病原体的清除甲壳动物主要通过体液免疫和细胞免疫清除入侵的病原微生物，在其免程中，细胞免疫和体液免疫相互配合、相辅相成。例如甲壳动物的血细与细胞免疫，又能通过分泌各种免疫因子参与体液免疫，而体液免疫中些免疫因子又能促进细胞免疫效应（Kim 和 Kim, 2005）。除此之外，的补体成分在血细胞中合成后分泌到血淋巴中参与体液免疫，在体液免进一步促进血细胞对病原微生物的吞噬作用（Song 等., 2000）。节补体系统椎动物的补体系统

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