俄罗斯鲟Acipenser gueldenstaedtii幼鱼对饲料铜的需要和利用研究

发布时间：2020-06-22 22:45

【摘要】：铜是包括鱼在内所有动物的必需营养元素,铜以辅酶的形式在体内发挥生理作用,机体氧化还原反应、铁离子代谢、能量生成、胶原合成和脑神经递质生成等一系列生理生化过程都和铜有关。饲料铜是鱼类铜的主要来源,过量的铜会对鱼类造成氧化损伤和毒性作用。鱼体内铜含量的高低受到吸收和排出两个关键环节的影响,其中铜在鱼消化道内的吸收、利用过程过程尤为重要。影响鱼类饲料铜吸收的因素很多,铜的化学形式是其中最主要的一个因素。俄罗斯鲟Acipenser gueldenstaedtii是世界范围内广泛养殖的一种经济鱼类。迄今为止,俄罗斯鲟铜营养生理研究还比较滞后。为探究铜对俄罗斯鲟的基本生理作用,查明俄罗斯鲟饲料铜的需要量以及俄罗斯鲟对饲料铜的生物利用率,本文主要进行以下四方面的研究:1)饲料铜对俄罗斯鲟幼鱼生长、体组生化和抗氧化能力的影响;2)俄罗斯鲟对饲料铜水平响应的转录组学分析;3)俄罗斯鲟幼鱼对不同铜源的生物利用率比较研究;4)俄罗斯鲟铜转运蛋白克隆、组织分布及表达分析。取得的主要结果和结论如下:1.饲料铜对俄罗斯鲟幼鱼生长、体组生化和抗氧化能力的影响为探讨铜对俄罗斯鲟生长、体组生化和抗氧化能力的影响并估测俄罗斯鲟饲料铜的需要量,以硫酸铜(CuSO4·5H2O)为铜源向半纯合料中添加0、1、2、4、6、8和16mg/kg的饲料铜(实测值分别为0.3、1.5、2.4、4.4、6.2、8.3和16.1mg/kg)配制7种试验饲料。每种试验饲料分别投喂3缸俄罗斯鲟幼鱼(重量11.84 ± 0.07 g)8周,养殖期间水体铜含量0.8-1.2 μg/L。结果显示:饲料铜含量2.4-8.3 mg/kg组俄罗斯鲟增重率和饲料转化率显著高于0.3、1.5和16.1 mg/kg组,其中6.2 mg/kg组俄罗斯鲟增重率最高。饲料铜含量6.2-16.1 mg/kg组俄罗斯鲟全鱼和肝脏铜含量显著高于其他各组。饲料铜含量6.2和8.3 mg/kg组俄罗斯鲟肝脏铜锌超氧化物歧化酶活力、肝脏总抗氧化能力和血清铜蓝蛋白活力显著高于其他各组,肝脏丙二醛含量显著低于其他各组。各组鱼存活率、肝脏指数、内脏指数、肥满度、全鱼粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分无显著差异。以增重率、全鱼铜含量、肝脏铜锌超氧化物歧化酶和血清铜蓝蛋白活力为评价指标计算得到俄罗斯鲟幼鱼饲料铜需要量为7-8 mg/kg。结果表明水体中铜不能满足俄罗斯鲟的生长,生产中必须在饲料中额外补充铜,但过量添加铜也会导致俄罗斯鲟生长性能和抗氧化能力下降,建议生产中俄罗斯鲟幼鱼饲料铜控制在7-8 mg/kg。2.俄罗斯鲟对饲料铜水平响应的转录组学分析为更好地揭示铜的生理作用,需要进一步了解铜对俄罗斯鲟基因表达的影响,为此选择了饲料铜含量为0、6和16 mg/kg(简记为铜缺乏组、铜适宜组和铜过量组)组俄罗斯鲟肝脏进行转录组测序分析。Illumina测序结果显示,除去低质量片段后共拼接出72270条基因(unigene),平均长度1053 bp,N50长度1328 bp。与铜适宜组鲟相比,铜缺乏组共有1750个基因表达发生显著性上调,463个基因发生显著性下调。铜过量组发生显著性上调和下调的基因数目分别为3228和1938。GO分析表明,铜缺乏组有187个生物过程(BP),34个细胞组分(CC)和118个分子功能(MF)发生显著变化,对应的注释数目在铜过量组分别为225、29和140。KEGG分析表明铜缺乏组有30条通路发生显著性变化,铜过量组有38条通路发生显著性变化。上述发生显著性变化的功能和通路主要与能量物质(糖类和脂类)代谢、免疫功能和信号转导通路有关。试验结果提示铜主要通过能量和免疫相关途径来影响俄罗斯鲟的生长和生理功能,今后鱼类铜营养生理研究可聚焦在能量代谢和免疫相关通路。3.俄罗斯鲟幼鱼对不同铜源的生物利用率比较研究为研究俄罗斯鲟对饲料中硫酸铜(CuS04)、蛋氨酸铜(CuMet)和纳米氧化铜(CuONano)三种形式铜的利用率。向半纯合基础饲料(对照组)中添加2、4、6、8 和 16 mg/kg 铜的 CuMet 或 CuONano,4、6 和 16 mg/kg 铜的 CuSO4。每种饲料投喂3缸俄罗斯鲟(重量9.82 ± 0.08 g)8周,养殖试验结束后进行嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila攻毒和铜表观消化率测定。结果表明:与CuSO4相比,达到相同增重率、组织铜含量、抗氧化和免疫能力需要的CuMet和CuONano形式铜更少。CuMet和CuONano组鱼铜表观消化率高于CuSO4组,抗A.hydrophila感染能力也更强。CuSO4、CuMet和CuONano三种铜源最大增重率(WGR)、全鱼铜含量、铜表观消化率、铜锌超氧化物歧化酶活力(Cu-Zn SOD)、总抗氧化能力、溶菌酶、免疫球蛋白M含量分别在6、4和4mg/kg饲料铜组获得,最大值之间无显著差异。以WGR、Cu-Zn SOD活力、全鱼铜含量为评价指标,CuMet和CuONano的生物学效价约为CuSO4的1.5-2.0倍,根据铜源种类的差异俄罗斯鲟幼鱼饲料铜的适宜需要量为5-8 mg/kg。综上,CuMet和CuONano比CuSO4生物学效价更高,可以有效地被机体利用而减少俄罗斯鲟饲料中铜的添加量。这对控制养殖生产中饲料铜的排出、减少水环境污染有重要的借鉴作用。但CuMet和CuONano和CuSO4相比没有额外促生长效应,吸收效率的提高是导致生物效价升高的主要原因。4.俄罗斯鲟铜转运蛋白克隆、组织分布及表达分析为了解俄罗斯鲟对饲料中不同铜源吸收差异的原因,分别选择铜源生物利用率试验中铜水平为4、6和16 mg/kg组鲟样品从分子水平进行以下三方面研究:1)俄罗斯鲟铜转运蛋白Ctr1 cDNA全长克隆;2)俄罗斯鲟Ctr1、ATP7A和ATP7B在组织中mRNA表达;3)不同饲料铜源对俄罗斯鲟Ctr1、ATP7A、ATP7B、CCS和SOD基因表达的影响。试验结果:1)Ctr1在鳃、心脏、肝脏和前肠高表达,ATP7A在前肠、肝脏、脾脏和鳃,ATP7B在肝脏和鳃中表达量较高;2)克隆得到编码202个氨基酸的俄罗斯鲟铜转运蛋白Ctr1。该蛋白有三个跨膜区,N端和C端存在富含蛋氨酸的铜结合位点。3)鲟饲料中分别添加4和6 mg/kg饲料铜时,CuMet 和 CuNano 组鲟 Ctr1、ATP7A 和 ATP7B mRNA 表达量高于 CuSO4组,对应的Ctr1蛋白表达量在CuMet和CuNano组也较高。当饲料铜含量为16 mg/kg时,Ctr1蛋白表达量降低。Cu-Zn SOD和CCS荧光定量结果显示可能不存在转录水平的Cu-Zn SOD表达调控。以上结果显示,俄罗斯鲟饲料铜的主要吸收部位在前肠,肝脏是其铜代谢的中心器官。饲料中氨基酸螯合形式铜或纳米形式铜比硫酸铜更能够在RNA和蛋白水平上调铜转运相关蛋白的表达,从而有效提高了铜的消化吸收和保留率。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S965.215
【图文】：

稳态调节,哺乳动物,高等动物,主图

在内的高等动物，其体内的铜含量受到吸收、分配、存储和排泄等多个控（Ｇｒｏｓｅｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，１９９８ｂ；邋Ｋａｍｕｎｄｅ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２００１）。动物体内铜稳态调节的主图邋１－１邋所示（Ｍｅｒｃｅｒ邋ａｎｄ邋Ｌｌａｎｏｓ，邋２００３）。逡逑

细胞内,细胞

２．２鱼类铜的细胞转运机制逡逑铜的吸收、排泄和利用依赖于参与铜代谢的各组织在细胞水平上的铜转运机逡逑制。细胞铜转运机制也是维持细胞内铜稳态的基础（图１－２）邋（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１），逡逑细胞铜转运主要包括两方面内容：１）细胞膜上铜转运蛋白将细胞外的铜转入细逡逑胞或者将细胞内的铜转出细胞；２）细胞内的铜伴侣蛋白将进入细胞内的铜转运逡逑到相应的靶蛋白或者细胞器。铜进出细胞以及细胞内铜的再分配都需要依赖特异逡逑性的铜转运蛋白和铜伴侣蛋白，这些蛋白质主要有细胞膜上的铜特异性转运蛋白逡逑家族（Ｃｏｐｐｅｒ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｃｔｒ）家族，Ｃｕ－Ｐ邋型邋ＡＴＰ邋酶（ＡＴＰ７Ａ邋和邋ＡＴＰ７Ｂ）逡逑和二价金属离子转运体（ｄｉｖａｌｅｎｔ邋ｍｅｔａｌ邋ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，ＤＭＴ１）以及细胞内的细逡逑胞色素ｃ氧化酶铜伴侣蛋白（ＣＯＸ１７）、ＣＣＳ、ＡＴＯＸ１和金属硫蛋白ＭＴ。铜从逡逑１０逡逑

【参考文献】