基于高通量测序的河川沙塘鳢性别二态性研究

发布时间：2020-06-24 15:11

【摘要】：河川沙塘鳢(Odontobutis potamophila)主要分布于我国长江中下游地区。该鱼为淡水底栖小型鱼类,味道鲜美,具有丰富的营养价值,已成为一种具有发展潜力的水产养殖品种。河川沙塘鳢在生长过程中表现出显著的性别二态性,雄性河川沙塘鳢比雌性同期生长速度快30%以上。因此,养殖雄性个体比雌性有着更大的经济效益。然而目前关于河川沙塘鳢在性别决定与分化机制方面的研究非常有限,这在一定程度上阻碍了河川沙塘鳢单性(全雄)育种研究。本文以河川沙塘鳢为研究对象,对其性别二态性的分子调控机制展开研究。首先基于高通量测序技术对其性腺组织进行转录组与miRNA组联合分析;接着从其性腺转录组数据中筛选并克隆了与配子发生、性腺发育相关Piwils基因的cDNA全长,并对Piwils基因进行了生物信息学分析;最后,运用荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹及免疫组化技术,探究Piwils基因在河川沙塘鳢性腺发育及激素处理后的表达模式变化规律。主要研究结果如下:1.河川沙塘鳢性腺mRNA-seq和miRNA-seq联合分析基于Illumina高通量测序对河川沙塘鳢精巢与卵巢进行转录组与miRNA组联合分析,包括精巢(OT a,OT b,OT c)与卵巢(OO a,OO b,OO c)。转录组数据经过数据质控后共获得条287130130条clean reads。通过组装,共获得了 43494条 non-redundant genes 与 81051 条 transcripts。注释到 Swiss-Prot、Nr、Pfam、KEGG、KOG、GO 数据库的 All-unigene 分别为:19518、24291、19364、13895、18624、17358条。在精巢与卵巢中共发现了 16540个基因显著差异表达,其中8103个基因在精巢中显著上调,8437个基因在卵巢中显著上调。另外分别在精巢与卵巢中获得了 1130、1226个潜在SNP位点。miRNA组数据显示,精巢与卵巢中分别获得25512003与14111642条clean reads。共发现了 591个保守的miRNA并预测到了 85个新型miRNA,这些591个保守的miRNA属于164个miRNA家族。精巢与卵巢中显著差异的miRNA共有143个,在精巢中显著上调的miRNA有75个,在卵巢中显著上调的miRNA有68个。基于显著差异的miRNA与mRNA进行联合分析,共发现超过50000对具有相互调控关系的miRNA-mRNApairs,其中 27583 对 miRNA-mRNApairs 为负调控关系。挑选转录组数据中43个与性别决定分化相关的基因与miRNA组中前16位显著差异的miRNA进行荧光定量PCR验证,并构建它们之间的相互调控网络图。miRNA预测到关键靶基因的pairs包括miR-17a-Dmrt1、miR-17a-Foxl2等。2.河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因的克隆与表达分析采用RACE技术,克隆了河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因的cDNA全长,Piwil1与Piwil2基因的全长分别为2934bp与3484bp。Piwil1与Piwil2基因分别包括2568bp的开放阅读框(ORF),编码856个氨基酸;3195bp的开放阅读框(ORF)编码1065个氨基酸;5'UTR区和3'UTR区分别为179bp和187bp、138bp和151bp;分子质量分别为96.91kDa和118.71kDa;等电点分别为9.13和9.15。氨基酸序列分析结果表明河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因均具有保守的PAZ与PIWI结构域。氨基酸序列比对、系统发育树结果均表明,河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因在硬骨鱼类的进化过程中高度保守。运用荧光定量PCR技术,检测了河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因在精巢、卵巢、肝、脑、鳃、心、肾、肠、肌肉、脾等10种组织中的表达情况,结果显示,Piwil1与Piwil2在精巢、卵巢有极高的表达量。通过荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹技术,检测了河川沙塘鳢Piwil1与Piwil2基因在性腺Ⅰ-Ⅳ期发育过程中的表达模式,结果表明Piwil1与Piwil2的mRNA和蛋白表达量均在河川沙塘鳢精巢与卵巢发育的Ⅰ期达到峰值,并在随后发育过程中呈显著下降的趋势。免疫组化结果显示,Piwil1与Piwil2蛋白在精原细胞、精母细胞以及早期卵母细胞中具有较高的表达量,而在成熟的精子及卵母细胞中不表达。通过向河川沙塘鳢体内注射激素(HCG、LHRH-A2)后,性腺中Piwil1与Piwil2的mRNA与蛋白表达量均显著下降。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

第２章河川沙塘鳢性腺ｍＲＮＡ－ｓｅｑ和ｍｉＲＮＡ－ｓｅｑ联合分析８ｐＬ，灭菌水邋７．４ｐＬ，２ｘＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘｌＯ｜ＬｉＬ。逡逑（４）邋ＰＣＲ扩增条件为：９５°Ｃ预变性５邋ｍｉｎ；邋３０个循环，每个循环包括３０邋ｓ，退火３０邋ｓ，７２°Ｃ延伸３０邋ｓ；邋７２°Ｃ延伸５ｍｉｎ，４°Ｃ保存。逡逑（５）测序分析：ＰＣＲ产物送至上海捷瑞生物有限公司进行测序分析。逡逑实验结果逡逑河川沙塘销性腺ＨＥ染色逡逑实验所用河川沙塘鳢的精巢与卵巢均为ＩＶ期（图２．１）。即精巢含有大量以及成熟的精子，卵巢中主要为成熟的卵母细胞。河川沙塘鳢的性腺分均参考中华乌塘鳄（５０Ｓ／７７Ｃ而0逡逑

为获得河川沙塘鳢精巢与卵巢间显著差异表达的基因，运用ＲＰＫＭ方法对逡逑精巢（ＯＴａ，ＯＴｂ，ＯＴｃ）、卵巢（ＯＯａ，ＯＯｂ，ＯＯｃ）中所得到的ｃｏｕｎｔ数据进行分析。逡逑如图２．３所示，精巢与卵巢比较，共获得８１０３个显著上调基因及８４３７个显著下逡逑调基因（｜丨0§２『0丨（１（；１１３１１§６丨＞＝１，尸－￥３１１１６＜０．０５）。逡逑ｇ逦８１０３逦＾逡逑＿逡逑ＯＴｖｓＯＯ逡逑图２．３河川沙塘鳢精巢与卵巢之间的差异基因逡逑注：红色与绿色柱子分别表示在精巢与卵巢中显著上调的基因。逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ邋ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｆｏｒ邋ｔｈｅ邋ｔｅｓｔｉｓ邋ａｎｄ邋ｏｖａｒｙ邋ｉｎ邋ｇｏｎａｄ邋ｏｆ邋Ｏ．邋ｐｏｔａｍｏｐｈｉｌａ逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｒｅｄ邋ａｎｄ邋ｇｒｅｅｎ邋ｂａｒ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ邋ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｇｅｎｅｓ邋ｉｎ邋ｔｅｓｔｉｓ邋ａｎｄ邋ｏｖａｒｙ邋ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．逡逑２３逡逑

【参考文献】

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本文编号：2728029