波吉卵囊藻遗传转化体系构建的初步探索

发布时间：2020-06-27 21:08

【摘要】：波吉卵囊藻(Oocystis borgei)是高位对虾养殖池塘中后期常见优势种,其种群稳定适应能力强,能有效降低养殖池塘水体中氨氮和亚硝态氮等有害物质,在对虾养殖水体调控方面发挥着重要作用。十多年来,实验室开展了波吉卵囊藻的培养生物学的研究和应用推广,其应用价值已经在对虾养殖中得以体现,但目前国内外对其分子生物学研究几乎空白,同时缺少相应的研究工具。因此本文以波吉卵囊藻作为实验材料,首次尝试通过基因工程技术手段构建其遗传转化体系,并对波吉卵囊藻进行了转录组测序与分析,从而为波吉卵囊藻的分子生物学相关研究提供工具和依据。研究内容和结果如下:(1)本研究通过测定藻体生物量、叶绿素含量及观察藻液颜色变化,综合评定了波吉卵囊藻对10种抗生素的敏感性。结果表明:(1)波吉卵囊藻对博来霉素非常敏感,25μg/mL的博来霉素即能完全抑制藻体生长,叶绿素含量极显著低于对照组(P0.01),藻体颜色发黄变白,可作为波吉卵囊藻遗传转化中的筛选试剂;(2)红霉素和氯霉素各浓度的处理都会使藻体生物量和叶绿素含量极显著降低(P0.01),但是溶解红霉素和氯霉素的乙醇溶剂会对藻体生长产生抑制,不适用作筛选试剂;(3)波吉卵囊藻对氨苄青霉素、遗传霉素、庆大霉素、羧苄青霉素、青霉素以及卡那霉素不敏感,这几种抗生素甚至在一定的浓度内还会促进藻体的生长和/或叶绿素含量的提升。此外低浓度的链霉素亦可促进藻体叶绿素含量的提升。(4)在固体培养条件下3μg/mL的博来霉素即能抑制波吉卵囊藻的生长,可作为波吉卵囊藻的遗传转化筛选试剂。(2)通过离心洗涤法有效的去除波吉卵囊藻中霉菌污染后,再采用溶菌酶预处理结合抗生素(400μg/mL氨苄青霉素、400μg/mL庆大霉素、400μg/mL卡那霉素和200μg/mL链霉素)的方法去除藻液中的细菌,通过显微镜镜检观察及细菌和真菌平板检测,均未观察到杂菌的存在,由此获得了无菌的波吉卵囊藻,经五次传代培养后成功地建立了波吉卵囊藻的无菌培养体系。(3)本研究采用SYTOX~(TM)Green(SG)荧光染色法来评估波吉卵囊藻细胞膜的渗透性及完整性,确定了SG染色剂量为20μM,避光染色20min以上可以作为2×10~7个细胞/mL细胞密度的波吉卵囊藻的最佳染色条件。通过使用流式细胞仪结合SG染色法得出波吉卵囊藻渗透性和存活率的交叉点在550V左右,并将550V电压应用于质粒电转化实验中。本文以波吉卵囊藻细胞为受体细胞,通过电击法并采用上述得出的电击条件尝试将含有CaMV 35S启动子、Omega增强子、EGFP报告基因以及ble选择标记基因的载体pOb-EGFP-2A导入藻细胞中,以期构建出波吉卵囊藻的稳定遗传转化体系,该研究为波吉卵囊藻稳定遗传转化体系的构建提供了重要的参考资料。(4)本研究通过Illumina Hiseq高通量测序平台对波吉卵囊藻细胞进行了转录组测序。通过去除低质量的raw reads共获得6.05Gb Clean Data,利用Trinity软件对转录组数据进行从头组装,共获得了35,873条Unigenes,其中长度在1kb以上的Unigene有7,837条。采用BLAST相似性比对方法,把这些序列与NR、Swiss-Prot、KEGG、COG、KOG、GO和Pfam数据库进行比对,共有11,032条Unigene得到了注释。有5,201条Unigenes获得了GO注释并分类到46个功能类别中,有5,018条Unigenes被归纳到COG的26个功能分类,有9,327条Unigenes被归纳到eggNOG的25个功能分类,有6,276条Unigenes被归纳到KOG的25个功能分类.有4,945条Unigenes被KEGG注释,有8,331条Unigenes被Pfam注释,有5,844条Unigenes被Swissprot注释,有9,860条Unigenes被nr注释。从11,032条Unigenes中共找到2,617个SSR位点。波吉卵囊藻的转录组信息为今后相关研究与应用提供了丰富的资源和线索。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.3
【图文】：

17图 2-2 不同质量浓度的 10 种抗生素对波吉卵囊藻叶绿素含量的影响Fig. 2-2 Effects of ten antibiotics with different mass concentration on Chlorophyll content ofOocystis borgei除了直接测定藻细胞生长曲线和叶绿素含量，藻液颜色变化同样能够反应藻细胞的生长状态。从图 2-3 可以看出，与对照组(0μg/mL)鲜绿色藻液相比，经过高浓度的链霉素以及分别经不同质量浓度博来霉素、氯霉素和红霉素处理的藻液绿色不明显，

17图 2-2 不同质量浓度的 10 种抗生素对波吉卵囊藻叶绿素含量的影响Fig. 2-2 Effects of ten antibiotics with different mass concentration on Chlorophyll content ofOocystis borgei除了直接测定藻细胞生长曲线和叶绿素含量，藻液颜色变化同样能够反应藻细胞的生长状态。从图 2-3 可以看出，与对照组(0μg/mL)鲜绿色藻液相比，经过高浓度的链霉素以及分别经不同质量浓度博来霉素、氯霉素和红霉素处理的藻液绿色不明显，

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本文编号：2732106