三角帆蚌色素相关基因HcMitf和HcUros的鉴定分析及功能探究

发布时间：2020-06-30 05:28

【摘要】：三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)作为中国重要淡水养殖珍珠的育珠贝,具有较高的经济价值,其所产珍珠颜色艳丽多彩,而珍珠颜色直接影响其价值。已有的研究表明,三角帆蚌珍珠颜色与黑色素生成有关,同时也有研究在不同颜色珍珠中都发现了卟啉的存在,是影响珍珠致色的重要物质之一。本研究是基于实验室构建的紫色、白色三角帆蚌家系为研究对象,筛选与珍珠层颜色相关的小眼畸形先关转录因子基因和尿卟啉原Ⅲ合成酶基因,研究其与三角帆蚌贝壳珍珠层呈色中的作用与影响。主要研究结果如下:1.三角帆蚌小眼畸形相关转录因子HcMitf基因的克隆及其表达分析克隆得到三角帆蚌小眼畸形相关转录因子HcMitf基因(GenBank:MH349354)cDNA全长2664bp,包含1332bp的ORF,编码了443个氨基酸。HcMitf基因氨基酸序列包含一个螺旋-环-螺旋结构域(bHLH),没有信号肽。组织定量检测发现,HcMitf基因在各个组织中广泛表达,并且除了肠和闭壳肌外,与白色蚌相比,该基因在紫色蚌中的血液、外套膜、肾脏、鳃以及斧足中的表达极显著(P0.01)。原位杂交实验结论说明,HcMitf位于外套膜的背膜上皮细胞,并显示出了阳性杂交信号。2.三角帆蚌小眼畸形相关转录因子HcMitf基因的功能探究首先,利用RNAi技术探究HcMitf基因与下游HcTyr基因在黑色素合成过程中的作用。通过注射HcMitf的dsRNA干扰链,结果显示:与空白对照组相较而言,阴性对照组的这两个基因表达量均未有显著变化,而实验组的表达量降低了78%(p0.01),表明该干扰链成功抑制了HcMitf基因的表达,干扰效果较好,同时下游基因HcTyr表达也极显著降低。与此同时,总黑色素含量测试表明,实验组的外套膜总黑色素含量显著低于空白对照组。其次通过插片手术,探究了HcMitf和HcTyr在三角帆蚌珍珠早期发育过程中的表达变化及其相关性。在插片手术后,HcMitf和HcTyr的表达均在6h达到了顶峰,并且在96h回到正常值。随后HcMitf在14d表达量相较于正常值又有显著提高,而HcTyr表达量则在35d有了显著差异。同时通过correl函数将这两个上下游基因的表达量进行线性相关分析,发现两者具有相关性(R=0.919)。3.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros基因的克隆及其表达分析通过分子克隆技术得到HcUros基因(GenBank:MK599473)cDNA全长1448bp,包含858bp的ORF,一共编码了285个氨基酸,没有信号肽。经荧光定量检测发现,HcUros基因在紫白色蚌各个组织中表达较为广泛,并且该基因在紫色蚌中的表达量都高于白色蚌中的表达量,并且与白色蚌相比,在紫色蚌的外套膜和血液中的表达量显著(P0.01)。原位杂交定位实验结果显示,HcUros位于外套膜的背膜上皮细胞,出现阳性杂交信号。4.三角帆蚌尿卟啉原Ⅲ合成酶HcUros的功能探究首先通过RNAi技术探究HcUros基因与下游HcPpo基因在卟啉合成途径中的调控关系。通过注射HcUros的dsRNA干扰链,结果显示:与空白对照组相比,阴性对照组中HcUros的表达量未有明显的变化,而实验组的表达量降低了62.5%(p0.01),表明该干扰链成功抑制了HcUros基因的表达,干扰效果较好,同时下游基因HcPpo表达也显著降低。其次通过插片手术来研究HcUros在三角帆蚌珍珠早期发育时期中的参与调控。在插片实验后,HcUros的表达量在3h显著降低后一直到48h和96h又显著升高,7d又回到正常值,最后在28d表达量达到峰值。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

图 2-1：左图为紫色三角帆蚌的内壳色，右图为白色。Fig2-1;Inner shell color of H. cumingii. Left:The purple (P-) mussel line; Right: white (W-).2.1.1.2 实验仪器设备仪器名称 仪器来源微量移液器 德国 Eppendorf 公司高速冷冻离心机 德国 Eppendorf 公司连接仪 德国 Eppendorf 公司HVE-50 型高压灭菌锅 日本 Hirayama 公司液氮 成都金凤液氮容器有限公司NanoDrop 2000C 型 OD 仪 美国 Thermo Fisher Scientific 公司BS124S 型多功能精密电子天平 德国 Sartorius 公司超纯水仪 Millipore 公司电泳槽 北京六一仪器厂

上海海洋大学硕士学位论文Fig.2-2：Full-length nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the HcMitf (Geneaccession is MH349354). The gray box indicates the predicted basic helix-loop-helix (bHLH)domain and the predicted polyadenylation signal AATAAA is underlined.2.2.2 多重比对与系统进化树分析使用 ClustalW 软件进行多重序列比对分析（图 2-3A），选取不同物种中的MITF 与获得的 HcMitf 进行比对，发现它们之间有着较高的相似度。用 MEGA5.2将不同物种的 MITF 蛋白序列构建系统进化树（图 2-3B），根据结果显示，HcMitf与中华文蛤（Meretrix petechialis）亲缘关系最近。

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本文编号：2734923