基于大鲵蛙病毒49L ORF的TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法的建立及应用

发布时间：2020-06-30 22:03

【摘要】：中国大鲵(Chinese giant salamander, Andrias davidianus)俗称娃娃鱼,是现存最大的珍稀两栖动物,具有极高的经济价值,其养殖在我国华中、西南及西北等地区发展迅速。但随着养殖规模的迅速扩大,人为控温与高密度等养殖方式改变或破坏了大鲵的自然生活习性,致使大鲵抗病能力下降,各种疾病时有发生,给大鲵养殖业造成严重的影响。大鲵蛙病毒(Chinese giant salamander ranavirus, CGSRV)就是近些年来发现的一种严重危害大鲵健康的新病原,其属于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒属(Ranavirus)成员。该病毒感染大鲵引起体表溃疡,大量出血斑,头部与四肢肿胀甚至溃烂等症状,具有传播快、发病急、发病率与死亡率高等特点,故被广大养殖户称之为“大鲵的癌症”。为更好地保护大鲵养殖产业,减少经济损失,该病的早期、准确诊断在其预警上起着重要的作用,本研究拟建立大鲵蛙病毒qPCR检测技术,为大鲵蛙病毒的早期诊断与流行病学调查提供重要的技术手段。本研究根据大鲵蛙病毒(CGSRV)的49L这个名为US22家族基因的ORF区,设计了一对引物并进行PCR扩增,以获得该基因序列,将其与pMD19-T进行连接,再转化到大肠杆菌DH5a中,用于构建重组质粒pMD19-T-49 L。提取阳性质粒,测定重组质粒浓度,进行10倍梯度稀释作为标准品模板。设计特异性的引物和TaqMan MGB探针,进行TaqMan MG B荧光定量PCR扩增,优化反应程序,绘制标准曲线,建立大鲵蛙病毒49LORF的TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法,同时对该检测方法进行特异性、敏感性、重复性进行评估,并对疑似大鲵血液样品进行检测。结果显示,该US22家族基因序列长639 bp,与NCBI-Blast与Genbank比对证实与目的序列一致。在确定了TaqMan MGB荧光定量PCR的最佳退火温度为60℃后,绘制的标准曲线有良好的线性关系,相关系数为0.997,扩增效率为99.14%。该方法对大鲵蛙病毒的检测有高度特异性,与大鲵蛙病毒、云斑尖塘鳢病毒、淋巴囊肿病毒、鲤疱疹病毒Ⅲ型、嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、杀鲑气单胞菌、荧光假单胞菌和迟钝爱德华氏菌之间均无交叉反应。灵敏性良好,最低能检测到2.00×1O1copies/μL的标准品浓度,比常规PCR高出3个数量级浓度梯度(常规PCR能检测到2.00×104copies/μL的标准品浓度)。批内和批间重复的标准偏差均小于0.5,变异系数均小于2%,表明该方法的重复性好；在73份疑似样品的检测中,TaqMan MGB qPCR能检测到45份阳性样品,检出率61.64%,常规PCR检出阳性32份,且均与TaqMan MGB荧光定量PCR检出结果一致。TaqMan MGB qPCR较常规PCR的检测符合率Po值为82.19%,Kappa值为0.6537,两者一致性较好。但TaqMan MGB qPCR能够检测到更低浓度的阳性感染,较PCR的敏感性更佳。鉴于本研究建立的大鲵蛙病毒49L ORF的TaqMan MGB荧光定量PCR检测方法具有快速、特异、敏感、可重复、可定量、可同时对大批量样品进行检测、可通过血液检测的方式实现活体监测等优点,其在大鲵蛙病毒的早期潜伏感染的快速诊断具有重要意义。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S947.3
【图文】：

即每扩增一条ＤＮＡ链，就有一个巧光分子形成，实现了巧光信号的累积与逡逑ＰＣＲ产物形成完全同步。本研巧为实现良好的特异性使用的是Ｔ叫Ｍａｎ邋ＭＧＢ探逡逑针（图３邋），即在普通的ＴａｑＭａｎ探针基础上加入了邋ＭＧＢ邋（Ｍｉｎｏｒ邋Ｇｒｏｏｖｅ邋Ｂｉｎｄｅｒ）逡逑修饰基团，其采用非巧光萍灭基团，自身不产生焚光，可使本底信号的强度大大逡逑降低。ＭＧＢ探针可Ｗ比普通ＴａｑＭａｎ探针设计得更短，可使得探针设计变得更逡逑为容易，大大提氋了设计的成功率，ＭＧＢ修饰基团可Ｗ更好地提氋探针的Ｔｍ逡逑值，保证探针可Ｗ具有更好的特异性，且对于富含Ａ／Ｔ的模板可＆区分得更为逡逑理想。逡逑１１逡逑

３N２邋４９Ｌ邋ＯＲＦ的ＰＣ民扩增结果逡逑用引物ＦＩ、Ｒ１对ＣＧＳＲＶ的４９Ｌ邋ＯＲＦ进行ＰＣＲ扩增，于凝胶成像系统中逡逑观察扩增结果，见图５。由图可见，扩增条带与目的基因的片段长度一致。逡逑（ｂｐ）邋ＭＮ＾逡逑２０００－四逡逑１０００—ｍｍｎｉ逡逑７Ｓｎ邋￣＾ＢＳＫＳＫＢａＢｒｎｍ逡逑５００邋—逡逑２５０－

本文编号：2735878