达氏鳇（Huso dauricus）生长激素基因克隆及原核表达分析

发布时间：2020-07-01 01:13

【摘要】：达氏鳇(Huso dauricus)起源于距今一亿三千万年的白垩纪,自然种群集中存在于我国黑龙江流域的中下游,是世界上仅存的两种鳇鱼之一。达氏鳇是淡水水域中个体最大的鱼类,其鱼肉营养丰富、鲜香味美,其中它含有的不饱和脂肪酸和造血维生素叶酸是其他鱼类的3~5倍;其卵制成的鱼子酱更是极其美味,售价较高,被誉为“黑黄金”,因此达氏鳇具有极高的经济价值。生长激素(Growth hormone,GH)是由动物脑垂体合成、储存、分泌的一种单一的肽类激素,能够促进其生长、发育。鱼类生长激素不但具有一般生长激素所具有的作用,还能加快合成蛋白质、加速降解脂类等功能,此外还拥有调控渗透压特别是海与河间洄游性鱼类的渗透压、提高饵料吸收效率等作用,因此在水产养殖领域有着巨大的应用价值。近年来,由于过度的捕捞,使达氏鳇的野生数量锐减,个体也趋于小体化且因其生长周期长,所以应用生物学手段,加快开展其生长激素等相关基因的研究至关重要。本研究采用反转录PCR(Reverse Transcription,RT-PCR)和快速c DNA末端扩增法(Rapid Amplification of c DNA Ends,RACE)首次克隆出达氏鳇生长激素全长c DNA,应用其全长序列对达氏鳇的分子系统进化进行了比对研究,旨在为从分子水平研究达氏鳇生长激素作用特点、进化机制以及在形态分类基础上研究达氏鳇的分类地位提供理论依据,并为以后能够更深入研究该基因做铺垫。同时,应用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)技术,对达氏鳇10种常见组织中的GH m RNA表达量进行了定量分析,从而进一步了解鱼类GH是否能以旁分泌或自分泌的方式对其生长、发育及繁殖起到重要的作用。最后,将生长激素基因进行原核表达,并对蛋白表达条件进行了优化,为达氏鳇GH基因的开发和利用奠定基础。实验结果如下:第一,采用RT-PCR方法得到达氏鳇生长激素中间片段、采用RACE方法得到3’、5’端片段,并将它们拼接在一起,得到达氏鳇生长激素全长c DNA,总长为1004bp,其中5’非编码区为47bp、3’非编码区(含Poly A尾30bp)为312bp,开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)为645bp。经过BLAST分析ORF的碱基组成,AT占51.32%,GC占48.68%,共编码214个氨基酸,分子量为24.25k Da,理论等电点为6.82。翻译起始密码ATG,终止密码TAG。基因及推导的蛋白序列已登入Gen Bank,序列号为:KP055783。达氏鳇与其他鲟形目鱼类的GH成熟肽进行对比,其氨基酸序列几乎相同,其一致性高达98.89%。同源性分析,结果显示达氏鳇与欧洲鳇同源性最高为98.5%,歧化性为1.3%;使用NJ法建立分子进化树,结果显示达氏鳇相对于哺乳类动物,如家鼠和人,它们之间的亲缘关系最远,与同是硬磷总目的雀鳝目中的长吻雀鳝和大雀鳝的亲缘关系较近,而与欧洲鳇、达氏鲟、中华鲟的亲缘关系最近。第二,采用Quantitative Real-time PCR方法检测了GH基因在达氏鳇肌肉、性腺、胃、脑垂体等10种不同组织中的表达情况。结果显示,GH基因不同组织中存在差异性,GH m RNA的表达量在脑垂体中最高;肌肉、脑次之;而在肠、性腺、胃、心脏、鳃、肝脏、脾脏中只有少量表达。第三,将达氏鳇GH基因连接到表达载体Blunt E1中,构建成Blunt E1-OFR重组质粒。将该质粒转化到BL21(DE3)菌株后,优化其表达条件,经过大量实验发现,当IPTG为0.6mmol/L,在37℃条件下培养5 h,可得到大量蛋白。经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-Polyacrylamide Gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析后,发现在31k Da左右有蛋白条带,且与预测蛋白的大小相接近。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

GH作用纵观图

实验流程,达氏鳇

能够促进其生长、发育[28]。鱼类生长激素分子量为 22kDa 左右，编码的约 200 个左右。在鱼类中，分类地位相近的其生长激素氨基酸组成几乎相同位较远有比较大的不同，显现出较为显著的种属特异性[29]。鱼类生长激素不般生长激素所具有的作用，还能加快合成蛋白质、加速降解脂类等功能，此外还渗透压特别是海与河间洄游性鱼类的渗透压、提高饵料吸收效率等作用，因此在领域有着巨大的应用价值[33]。达氏鳇（Huso dauricus）隶属鲟科（Acipenseridae），鳇属（Huso）。物种起源亿三千万年的白垩纪，自然种群主要分布在我国黑龙江中下游，是世界上仅存的之一，另一种为欧洲鳇（Huso huso），为冷水鱼类。达氏鳇是淡水水域中个体最，其鱼肉营养丰富、鲜香味美，其中它含有的不饱和脂肪酸和造血维生素叶酸是的 3～5 倍；其卵制成的鱼子酱更是极其美味，售价较高，被誉为“黑黄金”，因鳇具有极高的经济价值[9]。本实验的特异性引物通过对比鲟科鱼类 GH 基因保守区，应用 Primer primer 5计，采用 RT-PCR 和 RACE 技术首次克隆出达氏鳇 GH 全长 cDNA（见图 2-1）子水平上了解达氏鳇生长、繁殖等规律做铺垫。

【参考文献】