传染性胰脏坏死病毒RT-LAMP检测方法的建立及应用

发布时间：2020-07-04 23:00

【摘要】：传染性胰脏坏死病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus,IPNV)是引起传染性胰脏坏死病(Infectious Pancreatic Necrosis,IPN)的病原体。IPNV具有高度传染性,死亡率高达90%,幸存的鱼终生携带病毒。随着我国鲑鳟鱼类养殖规模的逐渐扩大,该病也日趋严重,而国内尚无及时有效的防治IPNV的药物。因此,对水产品进行病原监测是控制该病传播的首选方法。病原的免疫学检测手段具有耗时长、灵敏度低、特异性差等缺点;分子生物学检测方法则需要昂贵的仪器,检测效果只能通过琼脂糖凝胶电泳来判断。环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是等温核酸扩增技术,在恒温条件下反应可在体外进1小时内完成。除了琼脂糖凝胶电泳检测外,LAMP检测结果还可以通过SYBR Green I荧光试剂染色后直接进行肉眼观察,适用于大规模现场检测。本试验针对国内现行的IPNV ChRtm213建立RT-LAMP检测手段。本试验以实验室分离保存的IPNV ChRtm213(Genbank收录号KX23491和KX23490)全基因组为靶基因,利用Primer Explorer V5引物设计软件设计4套引物,严格按照引物设计原则及注意事项进行引物筛选,比较4套引物扩增效率得到最佳引物组合。使用最佳引物对提取IPNV(Jasper)RNA进行RT-LAMP反应,并对试验反应条件进行优化。对已经优化的反应体系进行灵敏度试验、特异性试验以及临床初步应用试验。结果显示:引物B2扩增效果略优于其他三组,选择引物B2作为RT-LAMP反应的引物组。当Mg~(2+)终浓度为4 mmol/L~8mmol/L时、dNTPs终浓度为0.5 mmol/L~1.5 mmol/L、甜菜碱终浓度为0.0 mol/L~1.2mmol/L时,RT-LAMP反应体系检测效果最佳。反应在63℃的扩增产率优于65℃、67℃,体系在60 min即可完成反应。此方法不与传染性造血器官坏死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)及病毒性出血性败血症病毒(viral haemorrhagic septicaemia virus,VHSV)发生交叉反应;此方法相对比国外已发表的IPNV(Sp)RT-LAMP检测方法更适用于IPNV(Jasper)检测,其检测限为0.0008 fg/25μL。应用本试验所建立IPNV RT-LAMP检测方法进行临床初步应用,不同区域的7个肝脏和肾脏样本进行检测,凝胶电泳检测结果和颜色检测结果相一致。综上所述,本试验针对于国内流行IPNV血清型Jasper,所建立IPNV RT-LAMP方法。此方法的特异性良好、灵敏性高、比国外已发表的IPNV(Sp)RT-LAMP的检测技术更适用于检测国内流行株IPNV(Jasper),可通过颜色变化(阳性样本为荧光绿色,阴性样本为红棕色)来判定核酸变化的结果。本实验针对国内现行IPNV建立的RT-LAMP方法,具有特异性好、灵敏性强、检测结果可以通过肉眼观察直接判断等特点,且在实际应用中效果准确率高,为我国IPNV基层快速检测以及大规模检测提供支持。
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.415
【图文】：

对比图,对比图,垂直传播,肛门

IPNV 在美洲、欧洲、以及亚洲的日本都相IPN 相继在我国的甘肃[6]、山东[7]、山西[8]等地爆发。随出现了 IPN，病毒感染导致流行区域的虹鳟鱼出现大规模发地之一[9]。而上世纪的 80 年代到 90 年代，我国分离的R-299[12]。近几年，我国科学家从四川和云南各分离一株N 的高发季，一般水温处于 10~15℃时，发病率最高，鱼方式传播：一种是水平传播，这种方式是经由渔具、水播病毒；另一种则是垂直传播，经由无症状携带病毒的鱼垂直传播给后代。IPNV 可导致 14~70 天的幼鱼的死亡率带病毒，对水产养殖业带来巨大威胁[15]。触性和急性传染病，感染后的鲑鳟鱼其特征为肝脏和肾主要病症表现：游动异常、通体发黑、眼球突出、肛门压时可从肛门射出、食欲不振、腹鳍基部出现充血等症肿大、胰腺出现坏死、肠道有粘液渗出、腹腔有腹水。在有许多出血点，肝脏和胰腺的细胞核固缩，出现空泡，并坏死。

原理图,引物设计,原理

Polymerase），启动自动循环链置换反应，特异地扩增目的基因；此技术对于靶序列上 6 个各异的特异区域，设计 4 条特异性引物进行扩增，可在 1 h 内扩增出的靶序列拷贝数约为109~1010倍，具有高时效性[87]。LAMP 技术的扩增模板只能是 DNA，若扩增模板为 RNA 则必须在进行 LAMP 扩增之前利用一定浓度的反转录酶将 RNA 逆转录成 cDNA，实现对 RN模板的直接扩增，从而形成了 RT-LAMP 技术，这种改进使得 LAMP 技术在检测试验中有更多可能性[88]。1.3.2 LAMP 引物设计1.3.2.1 LAMP 引物设计原理引物的特异性是 LAMP 实验的决定性因素。LAMP 技术扩增基因的关键是设计四种特异性引物，并从待扩增的靶序列中选择六个特定区域。六个特定区域是 3’端的 F3c、F2和 F1c 以及 5’端的 B1、B2、B3；3’端的 F3c、F2c 和 F1c 区和 5’端的 B1、B2 和 B区；对应互补链的区位为 5’端的 F3、F2 和 F1 区以及 3’端的 B3c、B2c 和 B1c 区（图 2）。Mori Y[89]设计一对环引物以添加到 LAMP 引物中，添加环引物使得引物扩增的时效性高，但是在引物设计和筛选中它将变得更严格。上游内环引物的 Loop F 设计区位于 F1c 区和 F2c 区间，下游内环引物的 Loop B 设计区位于 B1c 区和 B2c 区之间。

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