长牡蛎低氧信号通路分子作用机制研究

发布时间：2020-07-12 18:07

【摘要】：氧是决定绝大多数动物生存的关键环境因子。生活在潮间带地区的牡蛎,由于周期性处于露空环境,经常遭受低氧胁迫(溶氧量小于2.0 mg/L)。另外,由于全球变暖和水体富营养化,使得水体低氧现象频发,亦对牡蛎养殖造成低氧胁迫。因此,低氧已经成为制约牡蛎健康养殖的重要环境因子。PHD-HIF通路是目前在哺乳动物中发现的唯一氧感知信号通路,阐明其作用机制对于解析牡蛎低氧胁迫响应的分子机制具有重要指导作用。本研究通过构建基因共表达网络筛选牡蛎低氧相关基因,发现HIF-α是低氧适应过程中的关键基因。随后,对牡蛎HIF家族进行功能研究,阐明其在低氧胁迫下的转录调控机制。同时分析HIF与其羟化酶PHD的互作关系,验证PHD的羟化酶活性及其对HIF-α的影响,以及HIF-α对PHD的负反馈调节机制。最后,通过分析HIF对低氧下糖酵解基因的转录调控,阐明长牡蛎低氧胁迫下的能量代谢机制。主要研究结果如下:1.HIF家族的鉴定及功能验证。我们通过加权基因共表达网络(weighted correlation network analysis,WGCNA)法分析牡蛎干露表达谱数据。通过对筛选获得的1330个差异基因进行网络构建,最终识别8个基因模块。功能富集分析发现其中一个模块主要富集在调控代谢方面,我们寻找该模块的枢纽基因,发现HIF-α处于较核心位置,推测HIF-α是低氧适应过程中的关键基因。随后,对牡蛎HIF家族进行功能验证。克隆鉴定牡蛎体内存在HIF家族的两个α亚基和一个β亚基,尤其是发现一条新的HIF-α类似物CgHIFα-like,其C-端保守性较差,且具有四个不同的mRNA异构体。qRT-PCR结果显示,HIF家族成员均在鳃组织中表达量最高。低氧下,牡蛎HIF家族的两个α亚基(CgHIF-α和CgHIFα-like)在mRNA和蛋白水平表达量均升高。而CgHIF-β的mRNA和蛋白水平不受低氧影响。另外,结合酵母双杂交,荧光素酶双报告和凝胶阻滞分析结果,证实CgHIF-α和CgHIFα-like蛋白均能够与CgHIF-β形成异源二聚体,并通过结合在低氧反应元件HRE上来转录激活低氧报告基因,表明牡蛎HIF家族成员具有低氧诱导因子功能活性。2.通过分析PHD酶的羟基化活性及其对HIF-α的影响,阐明PHD的氧感受机制。克隆鉴定两个牡蛎PHD2(CgPHD2A和CgPHD2B)及一个CgVHL基因,其中CgPHD2B具有三种可变剪切形式,除CgPHD2B-iso1,CgPHD2B-iso2和iso3均编码不完整蛋白。qRT-PCR结果显示,CgPHD2A广泛表达于各发育阶段及成体各组织中,而CgPHD2B三个剪切体具有不同的时间表达模式,其中CgPHD2B-iso1在发育早期表达量最高,且在发育过程中表达量整体呈下降趋势,而CgPHD2B-iso2和iso3表达量逐渐升高,表明具有功能活性的CgPHD2B-iso1可能参与细胞发育过程。功能研究表明,CgPHD2A能够羟基化修饰CgHIF-α上的P404和P504位点,从而抑制CgHIF-α的转录活性和蛋白水平,而且CgPHD2A对C-端的脯氨酸作用更强。通过构建N-端缺失突变体,进一步将CgPHD2A上与底物CgHIF-α结合相关的区域锁定在aa 176-283区域,该区域包含β2β3环结构域;而CgPHD2B蛋白不能够羟基化修饰CgHIF-α,也不会影响CgHIF-α的转录活性,蛋白模型预测表明CgPHD2B与CgPHD2A的主要区别在于β2β3环结构域处多了一小段氨基酸序列,可能会影响其对底物CgHIF-α的结合。3.阐明长牡蛎HIF-α对PHD的负反馈调节机制。蛋白亚细胞定位结果表明,CgPHD2A和CgPHD2B蛋白均定位在细胞质中,低氧能够增加CgPHD2A和CgPHD2B蛋白表达量,但不影响其亚细胞定位情况。另外,qRT-PCR分析表明短期低氧能增加CgPHD2A的mRNA表达量,通过将CgPHD2A基因启动子区序列构建到荧光素酶报告基因上,结果显示CgHIF-α能调控CgPHD2A的启动子活性。进一步研究表明CgPHD2A基因启动子区的-491到-125区间序列介导CgHIF-α诱导的转录。在该区域中,发现并证实了一个具有功能活性的低氧反应元件HRE;而CgPHD2B只在长期低氧下转录水平略微升高。荧光素酶报告基因实验结果表明CgPHD2B不受CgHIF-α转录调控。4.分析HIF-α对能量代谢关键基因的转录调控,阐明低氧胁迫下的能量代谢机制。低氧初期,牡蛎耗氧率增加,未产生有机酸,表明此时牡蛎行有氧呼吸;随后,牡蛎耗氧率持续性降低,琥珀酸、乙酸和丙酸等无氧呼吸终产物相继产生,表明牡蛎开启无氧代谢。另外,表达谱数据结果表明,低氧下糖酵解过程中的绝大部分基因mRNA表达量下调,但磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶PEPCK表达量却显著升高。通过PEPCK启动子序列分析,结合荧光素酶双报告基因实验证实HIF-α能调控PEPCK的启动子活性,表明低氧下,HIF-α能通过转录调控PEPCK来影响牡蛎能量代谢过程。综上所述,本文首次研究了软体动物牡蛎的低氧信号感知及转导通路的分子作用机制。结果显示海洋贝类具有更复杂的低氧调控机制,对于解释潮间带贝类耐低氧的分子机制有重要意义,也为揭示贝类大规模死亡提供科学依据。同时,牡蛎的研究,能够在果蝇和线虫两种模式生物之间搭建桥梁,为氧分子感受器的系统发生和演化痕迹的研究提供参考。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

模式图,生物耗氧,氧分压,低氧

图 1.1 п同氧分压н的两种生物耗氧模式（MO2，μmol/min/g）度低氧н两种生物均维持有氧呼吸，但采用п同形态生理适应机制；严重低氧生物均开启无氧呼吸（引自 Grieshaber et al.，1994）Fig 1.1 Two modes of oxygen consumption (MO2, μmol/min/g) at different PO2ifferent physiological mechanisms were used to maintain aerobic metabolism betweoxyregulator and oxyconformer during moderate hypoxia, whereas anaerobic procommences under severe hypoxia通常而言，鱼类和甲壳动物等具有较高（3-5 mg/L）的亚致死氧临界致死低氧耐受时间，亦即其低氧耐受性较差；软体动物的亚致死氧浓g/L），半致死低氧耐受时间长达 400 h，远超其他海洋动物，如牡蛎 20 °C 温度н半致死低氧耐受时间分别为 47.8，15.9 和 12.2 d （Ka2010）；刺胞动物、环节动物和棘皮动物等底栖动物的亚致死浓度低，

低氧,耐受性

图 1.2 п同海洋生物的低氧耐受性比较左：各类海洋生物的亚致死氧临界值；右：各类生物的半致死低氧耐受时间。Fish 鱼；Crustacea 甲壳类；mollusca 软体动物；Polychaeta 多毛类；Echinodermata 棘皮动物；Cnidaria 刺胞动物；Annelida 环节动物；Priapulida с步虫）（引自 Vaquer-Sunyer andDuarte，2008）Fig 1.2 The comparison of hypoxia tolerance in different marine animalsLeft: sublethal thresholds of marine animals, Right: median lethal time of marine animalsп论是为了应对环境氧分压降低或是生物自身需氧量增加所引发的氧匮乏，海洋动物都进化出了整套完善的行为、生化及分子机制来适应低氧。本章节综述了海洋贝类常遇到的低氧胁迫及其对应的低氧耐受机制。1.2.1 低氧下海洋贝类的生理响应机制

磷酸原,化学结构,天冬氨酸

图 1.3 部分磷酸原及其化学结构Fig 1.3 Chemical structures of some phosphagens2）天冬氨酸底物磷酸化。天冬氨酸у糖原发酵偶联。许多海洋无大量的自由氨基酸，其中甘氨酸、D，L-丙氨酸、牛磺酸、L-天冬酸和 L-谷氨酰胺占据绝大部分。早在 1973 年，Hochachka and Mu3）提出天冬氨酸和谷氨酸是低氧н能量代谢的底物。在早期无氧代у天冬氨酸底物偶联分别生成终产物丙氨酸和琥珀酸。糖原经糖酵酮酸，而丙酮酸转移天冬氨酸т的氨基生成丙氨酸，而天冬氨酸的酰乙酸则进步还原为苹果酸。苹果酸进入线粒体转化为延胡索酸琥珀酸。其中延胡索酸转化为琥珀酸会产生 ATP，而某些物种中琥转化为丙酸，此过程也会生成 ATP。在早期的无氧代谢中，L-天冬

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