大型海藻裂片石莼对弧菌的抑制特性研究

发布时间：2020-07-13 17:31

【摘要】：弧菌是海水养殖环境常见的病源菌,不仅是制约海水养殖业发展的重要因素,而且是威胁人类健康的食源性病原菌。抗生素药物大量投加虽能一定程度上抑制弧菌增殖,但同时也诱导了一些耐药弧菌的产生。近年来,多数研究显示大型海藻不仅具有净化水质功能,且从中提取的物质具有较强抗菌性,世界卫生组织也曾推荐从海藻提取抗生物质代替抗生素管理控制养殖病原菌问题。为进一步拓展大型海藻用于养殖水质修复,有必要研究海藻活体组织对弧菌的抑制特性,相关的研究报道仍然较少。为此,本文以典型大型海藻裂片石莼和和三株弧菌(副溶血弧菌标准株ATCC17802、海水养殖环境分离的野生副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2)为研究对象,重点从菌落可培养性、运动性和生物膜形成方面反映不同条件裂片石莼抑制作用下的弧菌生长活性,并通过转录组测序分析弧菌在藻作用后差异基因表达情况,以此揭示裂片石莼对海水养殖环境弧菌的抑制作用特性,主要研究结果如下:1.裂片石莼对弧菌可培养性抑制作用研究采用TCBS平板计数表征弧菌菌落可培养性,裂片石莼活体组织分别与三株弧菌共培养,可显著抑制副溶血弧菌标准株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2的可培养性。在12g/L藻密度持续培养3d以上,菌落可培养性抑制率均达到99%左右。在不同藻密度方式下,研究发现高密度藻(12g/L)持续作用对弧菌可培养性的抑制作用明显高于低密度藻(3g/L);菌悬液浓度越高时裂片石莼抑制作用下弧菌可培养零检测所需的时间就越长。2.裂片石莼对弧菌运动性和生物膜成膜能力抑制作用研究采用改良的泳动平板、蹭行平板分别观察弧菌泳动和蹭行行为,并用结晶紫染色法定量检测弧菌的生物膜生成量。结果表明不同条件下(不同藻密度、氮磷水平、盐度和菌悬液浓度)弧菌运动性和生物膜生成量明显受到裂片石莼抑制。裂片石莼作用3d后,弧菌生物膜形成最大量时成膜能力均被抑制,副溶血弧菌标准株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2分别在不同条件下获得最高抑制率,分别为67.10%、94.69%和88.50%;裂片石莼对副溶血弧菌标准株、副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2也分别在不同条件下获得泳动行为最高抑制率,分别为30.29%、20.26%和39.49%,蹭行行为抑制率分别为47.68%、39.49和31.8%。整体而言,裂片石莼活培养物可以有效将弧菌可培养状态转变为不可培养状态,并损害弧菌运动性及生物膜附着表面能力,且不同弧菌受裂片石莼抑制作用特性差异显著。3.弧菌转录组测序分析采用Illumina HiSeq XTM Ten测序平台对经裂片石莼作用前后的副溶血弧菌Vp1和溶藻弧菌Va2进行RNA转录组测序分析。差异基因筛选结果显示均有多个上调和下调基因,其中副溶血弧菌Vp1共得到210个显著性差异基因,包括90个上调基因和120个下调基因。通过GO功能富集和KEGG通路分析,副溶血弧菌Vp1差异表达基因主要富集在鞭毛组装、细菌趋化性和生物膜通路上,下调基因主要包括鞭毛蛋白FliC、鞭毛运动开关蛋白FliG和FliN、甲基接受趋化性蛋白MCP、趋化蛋白CheY和CheW等;溶藻弧菌Va2差异表达基因主要富集到嘧啶代谢、细菌趋化性和鞭毛组装,下调基因有尿苷磷酸化酶、鞭毛马达蛋白FliG。整体而言,这些基因的下调都与裂片石莼作用下弧菌运动性和生物膜成膜降低的结果对应。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.4
【图文】：

布图,样本,显著性差异,基因数量

图 4-1 样本基因表达分布图Fig 4.1 Sample gene expression distribution颜色代表不同范围的 rpkm 值，横坐标为样品，纵坐标为基因数量。因表达分析副溶血弧菌 Vp1 的样本 HD2 和 CG2 进行差异基因筛选，分析得异基因，其中有 90 个显著性差异的上调基因和 120 个显著性差异 4-2 为样本 HD2 和 CG2 差异表达基因的整体分布情况。通过对 HD3 和 CG3 进行差异基因筛选，分析得到 9 个显著性差异基因异的上调基因和 8 个显著性差异的下调基因。

火山分布,显著性差异,转录组

45图 4-2 差异基因表达火山分布图Fig 4.2 Differential gene expression volcano map掉的非显著性差异的基因，红色和绿色为显著性差异基用下副溶血弧菌 Vp1 转录组分析结果表达分析溶血弧菌 Vp1 共培养 24 h 后，通过对样本 HD2 和显著性差异基因中，与膜相关的差异基因如表 4

条目,转录组,功能分类,副溶血弧菌

图 4-3 副溶血弧菌 Vp1 转录组 GO 功能分类Fig 4.3 Gene ontology functional classification of Vibrio parahaemolyticus Vp1 transcriptome注：图中不同颜色表示所有基因富集的 GO Level2 条目按功能的分类，横轴为条目名称，纵轴表示对应条目的基因数量和其百分比。按照 GO 富集显著性，将生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）3 大类别中富集程度较高的结果列于表 4-11。表 4-11 GO 富集分析结果Tab 4.11 GO enrichment analysis resultsGO accession description categoryGO:0009636 response to toxic substance Biological processGO:0009228 thiamine biosynthetic process Biological processGO:0009229 thiamine diphosphate biosynthetic process Biological processGO:0009405 pathogenesis Biological processGO:0009408 response to heat Biological processGO:0006099 tricarboxylic acid cycle Biological processGO:0005576 extracellular region Cellular componentGO:0005886 plasma membrane Cellular component

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