嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙TLR4信号通路中IRF3、IRF7差异表达研究

发布时间：2020-07-15 09:03

【摘要】：近些年因疾病爆发、生境破坏等诸多因素、特别是环境中病原微生物的影响,导致全球两栖类种群数量呈锐减趋势,已引起了人们广泛关注。Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)作为机体识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP),在微生物侵袭时,使机体启动固有免疫应答,从而激活一系列信号级联反应引发针对病原体的特异性免疫应答。本研究以中国东北地区优势两栖动物东北林蛙(R.dybowskii)为研究对象,以蛙类易感病原微生物嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)为感染源,研究在嗜水气单胞菌胁迫下东北林蛙体内TLR4信号通路中核转录因子IRF3和IRF7的调控机制。本研究通过HE染色观察Ah感染东北林蛙后其肝脏组织病理学变化,采用高通量测序获得东北林蛙IRF3和IRF7序列设计引物,荧光定量PCR检测在Ah胁迫下其肝、心、肾、脾组织中TLR4信号通路中IRF3和IRF7 mRNA表达变化,为探明东北林蛙被细菌感染后其体内TLR4通路的作用机制奠定基础。实验结果显示:Ah感染后肝脏组织病理学观察所见,随着时间延长(12～72 h),肝细胞变性,呈空泡样变,细胞间隙增大,炎性细胞浸润逐渐明显。荧光定量PCR结果显示:东北林蛙TLR4信号通路中IRF3 mRNA在肝、心、肾、脾组织中均呈上调表达,在12h达峰值;IRF7 mRNA在肝、心、肾、脾组织均呈上调表达,且在肾、心中于12h达峰值,在脾、肝脏中则分别在24h和72h达到峰值。此外,IRF3 mRNA在肾脏和脾脏中上调表达峰值明显高于心脏和肝脏,其中尤以脾脏变化最为明显,为对照组的13.7倍(p＜0.01);IRF7 mRNA表达量在脾脏中变化最明显,为对照组的13倍(p＜0.01),其次在肾脏中表达量为对照组的9倍(p＜0.01),在肝脏中表达量最低,为对照组的1.3倍。本研究结果表明,嗜水气单胞菌对东北林蛙具有致病性,IRF3、IRF7参与了 TLR4信号通路的固有免疫应答。
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S947.2
【图文】：

生长曲线,嗜水气单胞菌,生长曲线

在７ｈ之前，ＯＤ值与活菌数量的增长呈正相关，在７ｈ之后，分光光度仪所测的数逡逑值没有太大的波动，趋近于平缓，而活菌计数法表明此时细胞己经出现了自溶的现象，逡逑或者有毒物质累积导致菌液中有大量死亡的细菌和细胞碎片，呈下降趋势（图３－１），而逡逑这一现象在生长曲线没有显示，说明活菌计数法更能准确的反映细菌生长趋势。逡逑？邋ＣＦＵ邋▲＿邋ＱＤ逡逑ＩＳ「逦ｉ逦１邋２，７逡逑￣邋0３逡逑「ｊ邋Ｉ邋Ｔ邋＞邋．邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋＿邋■邋■邋Ｉ邋■邋■邋■邋■邋■邋Ｉ邋■雪■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■■尨邋Ｉ邋Ｑ逡逑１．５邋２．Ｓ邋３．Ｄ邋４．５邋５．５邋Ｇ．Ｓ邋７．５邋１０逡逑生长时间／Ｈ逡逑图３－１嗜水气单胞菌生长曲线逡逑Ｆｉｇ邋３－１邋Ａｅｒｏｍｏｎａｓ邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ逡逑３．２东北林蛙形态观察逡逑３．２．１解剖学观察逡逑东北林蛙感染嗜水气单胞菌后表现为运动迟缓、趾部红肿并逐步蔓延至腿部。解剖逡逑学观察其腹腔积水，肝脏、肾脏、脾脏充血肿胀。其中尤以肝脏组织病变最为明显（图逡逑３－２）。逡逑ｒ逡逑－１６－逡逑

人工感染,瘀血,肝窦,菌液

逡逑图３－２嗜水气单胞菌感染东北林蛙解剖图逡逑Ｆｉｇ３－２邋ａｎａｔｏｍｙ邋ｃｈａｒｔ邋ｏｆ邋Ｒａｎｃｉ邋ｄｙｂｏｗｓｋｉｉ邋ｗｉｔｈ邋Ａｅｒｏｍｏｎａｓ邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ邋ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ逡逑３．２．２肝脏病理组织切片逡逑用ＬＢ培养基稀释对数期菌液至１邋ｘ邋１邋0７ＣＦＵ／ｍＬ邋Ａｈ组腹腔注射１邋ｍｌ菌液，其他对照组逡逑注射等量ＬＢ培养基、ＬＰＳ溶液。逡逑如图３－３所示，与对照组（ＬＢ）相比较，１２邋ｈ邋Ａｈ组肝窦扩张、瘀血（图３－３－Ｂ），逡逑ＬＰＳ组局部有出血点，色素沉积（图３－３－Ｃ）；邋２４ｈＡｈ组中央静脉扩张，局部有空泡（图３－逡逑３－Ｂ，），ＬＰＳ组肝窦扩张，其间充满大量血细胞（图３－３－Ｑ）；邋４８ｈＡｈ组细胞排列紊乱，色逡逑素沉淀，局部有瘀血（图３－３－Ｂ２）；邋ＬＰＳ组细胞间隙增大，出现大量的红细胞浸润（图逡逑３－３－Ｃ２）；逦７２ｈ邋Ａｈ组部分细胞核破裂溶解，细胞之间界限不清，呈空泡样变（图３－３－逡逑Ｂ３）；邋ＬＰＳ组肝细胞破裂，细胞核固缩、破裂溶解，肝组织出现广泛性炎症出血（图３－逡逑３－Ｃ３）0逡逑ＬＢ邋（ｃｏｎｔｒｏｌ）逦Ａｈ＋ＬＢ逦ＬＰＳ＋ＬＢ逡逑１２ｈ逦Ｖ

电泳图,肾脏,脾脏,心脏

３．３总ＲＮＡ提取结果逡逑１．５％琼脂糖凝胶电泳检测总ＲＮＡ质量，紫外分光光度计检测样品总ＲＮＡ邋ＯＤ值。逡逑结果显示：ＯＤ２６0／ＯＤ２８0比值在１．８－２．０之间，ＯＤ２６0／ＯＤ２３ｑ比值在１．８－２．２之间，图３－４是逡逑部分总ＲＮＡ电泳图，各样本可见２８Ｓ、１８ＳＲＮＡ条带清晰，说明ＲＮＡ没降解，无蛋白逡逑和其他污染，也无有机物／盐离子污染。质量符合ｑＰＣＲ要求，可进行后续实验。逡逑１逦２逦３逦４邋５逦６逦７邋８＾逡逑图３－４总ＲＮＡ电泳图（１、２代表肝脏，３、４代表心脏，５、６代表肾脏，７、８代表脾脏ＲＮＡ）逡逑Ｆｉｇ．３－４邋Ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ（１邋ａｎｄ邋２邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｌｉｖｅｒ，邋３邋ａｎｄ邋４邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｈｅａｒｔ，邋５邋ａｎｄ邋６邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ逡逑ｋｉｄｎｅｙｓ，邋７邋ａｎｄ邋８邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｓｐｌｅｅｎ邋ＲＮＡ）逡逑３．４邋ＲＴ－ＰＣＲ扩增结果逡逑由东北林蛙总ＲＮＡ反转录成ｃＤＮＡ，用Ｂｅａｃｏｎ邋Ｄｅｓｉｇｎｅｒ邋７设计的６对引物分别进逡逑行目的基因ＩＲＦ３／ＩＲＦ７的ＰＣＲ扩增，所得明亮清晰的单一条带，且无引物二聚体（见逡逑图３－５）。所测的片段大小与设计引物时需扩增的长度一致

【参考文献】