贻贝足丝抗氧化蛋白的重组表达及大弹涂鱼皮肤粘液蛋白质组分析

发布时间：2020-07-15 12:49

【摘要】：海洋中蕴藏着丰富的生物资源,地球上约80%的物种栖息在海洋中,海洋生物是生物功能蛋白和活性多肽等分子资源的重要来源。目前,海洋生物已经成为各种功能蛋白和活性多肽的资源宝库,大量从海洋生物中提取的功能蛋白(如鱼精蛋白、贻贝足丝蛋白、胶原蛋白和营养蛋白等)和药用多肽(如抗菌肽、毒素肽、抑癌肽和水解肽等)已经或正在成为蛋白质及多肽工程研究的先导分子。其中,贻贝足丝蛋白(Mussel foot protein,Mfp)具有极强的黏附能力,且不受水环境的影响,因而在医药、化工等多个行业具有广泛的应用前景,被认为是能替代现有化学胶黏剂的新型生物黏合剂。有研究表明多巴对于足丝蛋白的黏附以及分子内的交联具有重要作用,但多巴在贻贝足丝黏附过程涉及的氧化还原体系及其分子机制尚不明确。为进一步探索贻贝足丝中其他抗氧化蛋白的结构与功能,针对厚壳贻贝足丝中新鉴定到的一种富含甘氨酸和半胱氨酸的足丝蛋白(CG-protein)开展了重组表达以及相关功能研究;此外,鱼类皮肤粘液对于鱼类的生存具有极为重要的生理学意义。大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)是一种特殊的可以营两栖生活的硬骨鱼类。其皮肤粘液对大弹涂鱼的免疫防御、渗透压维持、呼吸等生理过程至关重要,但目前尚无大弹涂鱼皮肤粘液的分子组成的相关报道。为深入了解大弹涂鱼皮肤及其粘液在大弹涂鱼特殊生活习性中的生物学意义,开展了大弹涂鱼皮肤的微观结构观察以及其皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学研究。结果表明,新型足丝抗氧化蛋白CG-protein具有明显的抗氧化活性,且在足丝和足腺中具有特定的分布和复杂的相互作用蛋白体系。推测这种蛋白在贻贝足丝的黏附过程中起到了防止足丝蛋白被提前氧化的保护作用。上述研究进一步明确了贻贝足丝中存在多种抗氧化活性蛋白,这对深入了解贻贝足丝的黏附分子机理具有重要意义。针对大弹涂鱼皮肤及其粘液的研究表明,大弹涂鱼皮肤组织具有特殊的真皮囊泡结构,且囊泡内具有唾液酸化和磺酸化的粘性多糖存在,进一步的分析表明:大弹涂鱼皮肤粘液具有明显的广谱抑菌活性;采用转录组和蛋白质组结合策略,从大弹涂鱼皮肤粘液中鉴定到超过500种蛋白质分子存在,主要包括各种代谢有关的酶类和免疫相关蛋白,表明大弹涂鱼皮肤粘液具有复杂的分子组成和生理功能。上述研究一方面为深入了解足丝抗氧化蛋白的分子结构与功能以及开发基于贻贝足丝的新型抗氧化蛋白奠定了基础;另一方面,从大弹涂鱼的皮肤结构、皮肤组织转录组、皮肤粘液的抑菌活性以及分子组成方面获得系统的研究数据,为了解鱼类皮肤及其粘液的生物学功能获得了系统的研究数据,并为后续从中筛选和开发具有特殊活性的蛋白及分子标记物奠定了基础。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

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图 1-1 足丝盘蛋白Mfp-6的作用过程[26]Fig 1.1 The action process of plaque protein Mfp-61.2.1.7 前胶原蛋白前胶原蛋白(Precollagen，Precol)是贻贝足丝中一类非常重要的蛋白，其序列类似于胶原蛋白前体。目前已经鉴定到了至少三种前胶原蛋白，分别为前胶原蛋白-P(Precol-P)、前胶原蛋白-D(Precol-D)和前胶原蛋白-NG(Precol-NG)，它们沿着足丝纤维以梯度形式分布[27-29]。前胶原蛋白序列中均含有由重复片段(Gly-X-Y)n 构成的三螺旋结构域(其中 Gly为甘氨酸，X 为脯氨酸，Y 为羟脯氨酸)。这是足丝纤维富有韧性以及弹性的结构基础。Precol-P 分子量约为 95 kDa，分布于足丝纤维靠近贻贝机体的一端，包含 7 个独立的蛋白结构域：重复序列的N端和C端(存在于所有的前胶原蛋白中)、中央成胶原区域、两个类似弹力蛋白的结构域、两个富含组氨酸的蛋白域及富有弹性的卷曲结构增强了足

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皮肤粘液中的蛋白质可以通过不同途径到达靶向部位。细胞外物质的经典传递方式是通过分泌途径，其中蛋白质通过粗糙内质网上的核糖体合成并通过高尔基体加工递送至细胞膜(图 1-2)[73]。或者，蛋白质在胞质溶胶中合成，并通过转运途径或者通道或者其他非经典机制直接在细胞膜上通过转运途径递送[74-75]。膜囊泡(如外泌体和微泡)的非经典分泌可以传递 RNA 等除蛋白质之外的其他分子(图 1-2)。在陆地脊椎动物中不存在皮肤粘液，但是在大西洋鳕鱼(Gadus morhua)皮肤粘液中鉴定到的许多分子[76]也存在于哺乳动物子宫颈粘液[77]中，并且表明粘液的运输机制也是保守的。粘液蛋白也可以由表皮表面丢失的死细胞产生。通过非经典分泌途径的递送可能是粘液产生的特征之一，因为许多蛋白质除了已知的经典功能外还具有其他功能，具有多种功能的蛋白质通常被称为“兼职蛋白”[78]或“基因共享”蛋白[79]。例如，组蛋白在 DNA 包装和基因调控中具有积极作用[80]，同时也具有抗菌作用[81]。

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第一章综述上调[93]。在鲈鱼皮肤粘液中发现了岩藻糖结合凝集素[92]。在欧洲鲈鱼[92]和大西洋中发现，凝集素类似物结合钙网蛋白诱导对微生物的吞噬作用。研究表明，通过 2D观察到的蛋白分子量高于预测的蛋白分子量，这表明蛋白质可以被糖基化，例如PAGE 中观察到的人类钙网蛋白的分子量高于其实际分子量。

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