斑马鱼低温响应基因顺式调控元件的鉴定及鳞头犬牙南极鱼ATP6V0C基因在HeLa细胞中抗寒研究
发布时间：2020-07-18 16:06
【摘要】：水温能直接影响变温动物硬骨鱼类的转录程序。然而,硬骨鱼类响应温度系统的分子机制到目前为止还不为人知。我们使用RNA-seq的方法,对梯度低温处理后的斑马鱼的8个组织进行转录分析。处理温度是从正常温度(28℃)到中度低温(18℃)再到极端的低温(10℃)。对差异表达基因使用模糊k值聚类算法,结果表明这些基因被分类到34个不同表达模式的基因clusters中,这说明斑马鱼对低温的组织特异性响应和普遍的交叉响应之间存在一定的联系。对这些基因参与的生物学过程进行GO分析,发现有31个GO term分类涉及到不同的细胞生理过程,例如RNA剪接和质子运输;涉及到组织特异性进程,例如在肾组织中的“肽链内切酶的负调控”。表现出相似表达模式的基因很可能在转录水平上是受到共调控的。而这种共调控是通过顺式作用元件和反式作用因子的程序性相互作用来实现的。我们通过对这些clusters涉及到的基因使用DREME算法,从聚类的基因的上游启动子区域的1kb以内的序列中,筛选富集的核苷酸序列-motifs。被找到的motifs的p值是根据超几何分布计算的,各组中被找到的motifs的p值小于1x10-4,该motifs才能被视作是具有显著性的。因此当生物体受到低温胁迫时,这些motifs可能在其调节网络中起到重要作用,即某个motif控制含有该motif的基因,使其具有相似的表达模式。使用TOMTOM工具把所有找到的motifs和JASPAR数据库里的已知的motifs进行比对,总共发现了17个motifs。其中10个motifs的序列和JASPAR数据库里的已知的转录因子结合位点相同,因此,这些motifs被视作已知的motifs。寻找特异性motifs所涉及到的所有基因,在整个clusters中的百分比是不一样的,最高的百分比达到了48%,这表明这个cluster中有接近一半的共表达基因受到这个motif调控。我们选取新发现的AGMAACCA motif和已知的AP-1 motif在细胞系中对其进行低温实验验证,经实验验证它们确实在低温压力下控制基因表达。这些富集的motifs和转录因子会在很大程度上促进优化低温响应作用通路。除此之外,为研究南极鱼ATP酶类在其低温适应下的作用,我们从鳞头犬牙南极鱼(Dissostichus mawsoni)的c DNA文库中克隆了ATP6V0C基因,并转染到He La细胞中,通过流式细胞仪检测细胞在低温胁迫下(10℃)的死亡率。我们获得了dm ATP6V0C基因的全部编码序列,其长度为462 bp,并将其插入到真核表达载体pc DNA3.1(-)上用于体外表达。冷胁迫实验结果显示,与对照组相比较,在低温胁迫下,过表达dmatp6v0c基因的He La细胞的死亡率从19.23±1.87%降低到8.13±0.04%(P0.05)。这说明在低温胁迫下dm ATP6V0C基因过表达能显著降低He La细胞的死亡率,为dm ATP6V0C基因作为鱼类耐寒育种的候选基因提供了理论依据。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：
图 2.1 降温策略和样品采集示意图tic diagram showing the cooling time course and th 10℃停留 12h 后，每个温度点分别随机鱼分 8 个组织进行解剖，相同的组织收集
RPKM）大于 2 且校准过的 P-value 小于 0.001。差异表达基因在各组织中的分布情况(图2.2)。图 2.2 差异表达基因在各组织中的分布情况Figure 2.2 Venn diagrams showing the overlap of the genes with > 2-foldchanges among three comparisons18
还是和 18℃对 10℃组比较，28℃对 10℃组都是最少的（图 2.2）。出现这种现象的原因是在 18℃对 10℃组中发现的大量差异表达基因的变化方向是相反的(图 2.3)。简而言之，在几乎所有组织中上调基因的数目和下调基因的数目几乎相等（图2.3）。图 2.3 三种温度比较中差异表达基因在组织中的分布及变化趋势Figure 2.3 The tissue distribution and change trend of differentially expressed (DE) genesthat have a greater than 2-fold RPKM difference in three comparisons (28°C versus 18°C,18°C versus 10°C and 28°C versus 10°C)2.3.2 基因聚类分析区分基因的一般表达模式和组织特异性表达模式在多个组织中分析低温压力下的斑马鱼的转录组变化，为了将表现出相同调节趋势的基因进行归类，我们用模糊 k 值聚类方法（fuzzy k-means clusteringmethod）对差异表达基因进行分类。模糊 k 值聚类方法被广泛应用于复杂的数据19
本文编号：2761118
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：
图 2.1 降温策略和样品采集示意图tic diagram showing the cooling time course and th 10℃停留 12h 后，每个温度点分别随机鱼分 8 个组织进行解剖，相同的组织收集
RPKM）大于 2 且校准过的 P-value 小于 0.001。差异表达基因在各组织中的分布情况(图2.2)。图 2.2 差异表达基因在各组织中的分布情况Figure 2.2 Venn diagrams showing the overlap of the genes with > 2-foldchanges among three comparisons18
还是和 18℃对 10℃组比较，28℃对 10℃组都是最少的（图 2.2）。出现这种现象的原因是在 18℃对 10℃组中发现的大量差异表达基因的变化方向是相反的(图 2.3)。简而言之，在几乎所有组织中上调基因的数目和下调基因的数目几乎相等（图2.3）。图 2.3 三种温度比较中差异表达基因在组织中的分布及变化趋势Figure 2.3 The tissue distribution and change trend of differentially expressed (DE) genesthat have a greater than 2-fold RPKM difference in three comparisons (28°C versus 18°C,18°C versus 10°C and 28°C versus 10°C)2.3.2 基因聚类分析区分基因的一般表达模式和组织特异性表达模式在多个组织中分析低温压力下的斑马鱼的转录组变化，为了将表现出相同调节趋势的基因进行归类，我们用模糊 k 值聚类方法（fuzzy k-means clusteringmethod）对差异表达基因进行分类。模糊 k 值聚类方法被广泛应用于复杂的数据19
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 胡雪松;李池陶;徐伟;曹顶臣;贾智英;石连玉;;黑龙江鲤、德国镜鲤选育系与荷包红鲤抗寒品系生长及越冬体重损失的初步研究[J];水产学报;2010年08期
本文编号：2761118
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/2761118.html
