日本沼虾表皮蛋白基因的克隆及分析

发布时间：2020-07-20 14:32

【摘要】：甲壳动物有着坚硬的表皮,也被称为外骨骼,作用是维持其物种特异性形态,保护并使之与外部环境隔离。甲壳动物通过周期性蜕去旧的表皮产生新表皮来进行生长发育。表皮主要由几丁质、蛋白质与碳酸钙构成,表皮蛋白(cuticle proteins,CPs)与几丁质结合形成纤维骨架控制表皮的钙化,对新表皮的形成起到极其重要的作用。本实验室前期研究发现,咪唑类物质KK-42能显著缩短日本沼虾(Macrobrachium nipponense)幼虾的蜕皮周期,推测CPs可能是其作用的靶分子。CPs作为主要的结构性蛋白,理论上,其表达水平及其表达的时序性改变会影响表皮的厚度,进而影响蜕皮周期的进程。本实验以实验室前期转录组测序为基础,通过NCBI Conserved Domain Search筛选含chitin_bind_4结构域的目标基因,采用qRT-PCR技术定量研究相关基因的时空表达及KK-42处理后基因表达的变化,分析它们与蜕皮周期之间的联系,为阐明KK-42缩短日本沼虾蜕皮周期的机制积累资料。将500尾体长3.0±0.5 cm的日本沼虾分为实验组和对照组,实验组用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液浸泡1 min,对照组用不含KK-42溶液处理。于处理后0、3、6、12、24和48 h,取处于C、D0-2、D3-4和A期的尾扇、腹肢和步足表皮提取mRNA,用于后续研究。结果如下:根据实验室发现CPs基因的先后顺序,将筛选出的3个基因分别命名为MnCP-6、MnCP-7和MnCP-8,已在NCBI GENEBANK数据库注册,注册号分别为KY399478、KY3399479和KY411918。通过测序发现长度分别为373 bp、759 bp和1183 bp。经NCBI Blastx比对,MnCP-6与端足虫(Hyalella azteca,XP_018010163.1)相似性为70%,使用CutProtFam-Pred推测为编码RR-2家族蛋白;MnCP-7与端足虫(Hyalella azteca,XP_018010157.1)相似性为73%,推测同属于RR-2家族。MnCP-8与豌豆长管蚜(Acyrthosiphon pisum,XP_001950806.2)相似性为43%。上述3个MnCPs的转录水平在蜕皮周期的不同阶段以及不同的表皮组织呈现明显的差异。以尾扇中表达量为参照,在C期、D0-2期以及D3-4期,步足MnCP-6表达量腹肢;A期,步足中表达量腹肢。MnCP-7在C期与A期表达情况类似,腹肢中表达步足;在D0-2期各组织内表达水平相当;D3-4期步足表达量最高。在C期、D0-2期和D3-4期,步足MnCP-8表达最高;A期,腹肢中表达量最大。KK-42处理可显著上调上述3个基因的表达,其中,尾扇MnCP-6基因在C、D3-4期被诱导的表达量显著升高;步足MnCP-7基因表达量在C期升高,至D0-2期呈下降趋势;在D3-4和A期,腹肢中MnCP-8表达呈先升高后降低的趋势。
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4;Q78
【图文】：

构组分的血蓝蛋白又称血蓝素，过去被称为呼吸蛋白，最新研的贮存、渗透压的维持及蜕皮过程的调节有关，其裂解产生的关。血蓝蛋白功能多样，涉及到激素、酚类和一些 CPs 的转运目的和意义对蜕皮的影响生物 KK-42，化学结构为 1-苯甲基-5-[(E)-2,6-二甲基-1,5-庚二烯 kuwano 等人发现，作为保幼激素拮抗物主要用于蚕养殖业，卵巢发育，研究发现 KK-42 可以明显促进家蚕幼虫的生长发育

第三章 结果虾总 RNA 提取结果 TaKaRa RNA 提取试剂盒，从对照组和 KK-42 处理后 0、组中，分别提取处于 C、D0-2、D3-4和 A 期的日本沼虾尾扇 OD260/280的值在 1.8～2.2 之间，并使用凝胶电泳检测表明 RNA 可用于后续实验。下图为 C 期 RNA 电泳图。

GENEBANK 数据库注册，注册号分别为 KY399478、KY3399479 和 KY411918。通过测序发现长度分别为 373 bp(图 3-2)，759 bp(图 3-4)、1183 bp(图 3-6)；经 NCBI Blastx 比对，MnCP-6 与端足虫(hyalella azteca, XP_018010163.1)相似性为 70%(图 3-3)，使用CutProtFam-Pred 推 测 为 编 码 RR-2 家 族 蛋 白 。 MnCP-7 与 端 足 虫 (Hyalellaazteca ,XP_018010157.1)相似性为 73%(图 3-5)，推测同属于 RR-2 家族。MnCP-8 与豌豆长管蚜( acyrthosiphon pisum，XP_001950806.2) 相似性为 43%(图 3-7)。

【参考文献】

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1 关建义;吕艳杰;张宇;宁黔冀;;KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能机制[J];水产学报;2016年06期

2 吕艳杰;陈香丽;郭爱莲;王佩;宁黔冀;;KK-42对日本沼虾D_3期头胸甲表皮结构的影响[J];水产学报;2014年12期

3 田志环;康现江;焦传珍;;中华绒螯蟹蜕皮过程中体壁结构和主要成分的变化[J];水生生物学报;2013年05期

4 田志环;焦传珍;康现江;;中华绒螯蟹蜕皮过程中鳃组织主要成分及N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶活性变化[J];淡水渔业;2013年05期

5 刘方;陈香丽;郭爱莲;宁黔冀;;KK-42对日本沼虾蜕皮激素及其受体表达的影响[J];河南师范大学学报(自然科学版);2013年04期

6 欧阳昊;葛清秀;孙亮先;梁勤;;西方蜜蜂一个新表皮蛋白基因的克隆和结构分析[J];泉州师范学院学报;2011年06期

7 沈洁;朱冬发;胡则辉;亓一舟;汪春建;;三疣梭子蟹蜕皮周期的分期[J];水产学报;2011年10期

8 吴志威;周飞;;淡水龙虾螯的结构及力学性能的研究[J];中国科学:技术科学;2011年03期

9 赵小凡;;昆虫蜕皮激素信号转导途径研究进展[J];生命科学;2010年12期

10 赵红霞;;甲壳动物蜕皮调控研究及蜕壳素的使用[J];广东饲料;2006年01期

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2 陈香丽;咪唑类物质KK-42对日本沼虾表皮结构的影响[D];河南师范大学;2014年

本文编号：2763572