花鳗鲡三个激素受体基因及HSP基因的克

发布时间：2020-07-21 12:29

【摘要】：花鳗鲡是降海洄游性鱼类,具有很高的营养价值和市场开发前景,其幼鳗(鳗苗)须从海水迁移到淡水中生长发育。目前对花鳗鲡渗透压调节和免疫应答方面的探索,已经从细胞形态和病理检测水平转移到了分子机制水平的研究。但关于激素受体基因在洄游性鱼类盐度适应调节方面的研究和热休克蛋白(Heat shock proteins,HSP)在免疫应答方面的报道还很少。精氨酸催产素受体(Arginine vasotocin receptors,AVTRs)和异亮氨酸催产素受体(Isotocin rexeptor,ITR)属于G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor,GPCR),它们与配体结合之后,激活耦合的G蛋白,并启动多种信号转导途径产生多种生物学效应,在渗透调节过程中扮演着重要角色。此外,HSP常作为分子伴侣识别多肽,抵御不利刺激,发挥细胞保护功能。本文以花鳗鲡幼鳗为研究材料,初步探究AVTRs,ITR在不同盐度环境下的表达变化规律和HSP感染嗜水气单胞菌后的表达变化模式。具体研究结果如下:1.花鳗鲡AVTRs和ITR基因的克隆、鉴定与表达分析采用RACE技术,首次克隆了花鳗鲡AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因的cDNA全长,其中三者全长分别为3049 bp、2101 bp和2191 bp;分别包括1260 bp开放阅读框(ORF)编码419个氨基酸,1656 bp个ORF编码551个氨基酸以及1131 bp个ORF编码376个氨基酸;5'UTR区和3'UTR区分别为237bp和1552b、158bp和287 bp、69 bp和1060 bp; DNA star软件预测它们的分子量分别为47.784 KD、59.884 KD和42.970 KD,等电点分别为8.664、8.705和9.292;氨基酸序列分析结果表明每个受体都含有G蛋白偶联受体所特有的七次跨膜结构域。通过多重比较和系统进化树分析,发现花鳗鲡AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因在鱼类中高度保守。运用荧光定量PCR技术,检测花鳗鲡AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因在脑、鳃、肠、肝脏、脾、肾脏、肌肉和心脏8种组织中广泛分布,不同基因间有组织特异性。选取盐度0、盐度10(Brackish water, BW)和盐度25(Seawater,SW)的花鳗鲡脑、鳃、肠三种组织进行分析,结果AVTRV1a2、AVTRV2和ITR基因的mRNA均发生显著差异表达变化(P0.05)。通过蛋白质免疫印迹技术,检测脑组织中AVTRV1a2蛋白的表达量,结果表明它在BW组呈先升高后降低趋势,SW组显著下调。此外,在鳃组织中,探究了三个受体基因分别和三个离子基因NKAα1、CFTR和NHE8之间的相关性,结果表明三个受体基因和NKAα1、NHE8存在很强的相关性,与CFTR中度相关。2.花鳗鲡HSP90、HSP70和HSC70的鉴定与表达分析本研究首次克隆了花鳗鲡三个热休克蛋白基因(AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70)的 cDNA 的全长,分别为 2527 bp、2443 bp 和 2247 bp; ORF 分别为 2181 bp、1932 bp和1950 bp,分别编码726、643和649个氨基酸;预测分子大小分别为83.6、70.5 和 71.21 KD,理论等电点为 5.47、5.44 和 5.28; 5'UTR 和 3'UTR 分别为58 bp 和 288 bp、79 bp 和 432 bp、79 bp 和 218 bp。氨基酸序列显示 AmHSP90 含有一个典型的组氨酸激酶(histidine kinase-like ATPase)结构域,含有5个保守的HSP90蛋白家族信号,特征序列MEEVD位于AmHSP90的C末端,AmHSP70和AmHSC70都包含ATP/GTP结合位点A (ATP/GTP-binding site),一个双边核定位信号(KK和RRLRT)和HSP70家族的三个保守结构域,经典的细胞溶质模体EEVD位于3'末端。通过多重比对和系统进化树分析,结果表明三个热休克蛋白基因高度保守。采用荧光定量PCR技术检测了 AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在八种组织中的分布情况,结果表明,三个热休克蛋白在肝、肠、肌和心中表达量高于其它组织。通过注射生理盐水和嗜水气单胞菌单胞菌,AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在嗜水气单胞菌感染后其mRNA表达量均发生了显著变化。结果表明,四个组织中的AmHSP90、AmHSP70和AmHSC70在免疫应答过程中扮演着重要角色,特别是肝组织对嗜水气单胞菌有着更为敏感的免疫应答反应。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

ＡＶＴＲＶｌａ２在信号转导中发挥作用；ＡＶＴＲＶ２与所选物种的氨基酸序列相似性为逡逑３２．５７邋％一５３．４２邋％之间，一致性为邋６６．５０邋％，标志三联体邋Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｈｉｓ邋（ＤＲＨ）可使逡逑ＡＶＴＲＶ２在信号转导中发挥作用（图２．５）；邋ＩＴＲ与所选物种的氨基酸序列相似性为逡逑５３．７６邋％—７５．８２邋％之间，一致性为邋７４＿４７邋％，标志三联体邋Ａｓｐ－Ａｒｇ－Ｃｙｓ邋（ＤＲＣ）可使邋ＩＴＲ逡逑在信号转导中发挥作用（图２．６）。表明花鳗鲡三个激素受体蛋白在物种间高度保守，逡逑并且均有７个跨膜区，属于Ｇ蛋白偶联家族。逡逑：：：：：：逦泛悉；；疆；｜：逦＾逡逑ｗ邋：一：………‘媫！ｈ逡逑＝邋？我ｒｖｓｉｖｘｒｙ邋？＜ｆ逦－邋ＡＴ８＾３３？＂ＩＳＳ＾ＳＥ邋ｇｆＴｌ邋ｆｔ．Ｏ逡逑，．逦＇ｆｊｖｕ逦ｒｌＭ２邋＞ｖ邋龙１＂＇＊邋私．？逦ｖ？邋４．逡逑＿濯b\0二１１１翻＿W＿邋Ｉ逡逑■ｖＸｍｉ．ｖ．邋＇ｖｗｍｖ邋ｑｚｘ邋ｍｖＸＳ＊逦ｔｒｘｖｆ＾ｓＸｆＸ邋ｉｆｔ．Ｊｉ＊＊逦Ｋ邋ｘ：ｔ逡逑Ａｖｘ？ｖａ？ｚ邋．ｃｘ？逦“

本文编号：2764415