斑马鱼细胞低温驯化中的表观遗传调控机制研究

发布时间：2020-07-27 11:42

【摘要】：鱼类作为水生生物,在其生命周期中会面临大幅度的温度变化,而低温压力会对鱼类生理、行为造成显著影响,甚至导致死亡。低温驯化可以增强鱼类对低温的耐受能力。因此探索鱼类低温驯化的分子调控机制具有重要的意义。表观遗传在动植物适应环境压力的过程中起到了重要的作用。但是表观遗传在鱼类低温驯化中的作用并没有进行深入研究,特别是关于组蛋白修饰的研究很少,而关于长非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)方面的研究还是空白。斑马鱼作为一种常用的模式生物,其最适生长温度为28.5℃,而野生型斑马鱼要经历大幅度波动的日常(5.6℃)和季节性(15.0±0.4℃)温度变化,可以适应大幅度的温度变化(6-38℃)。因此斑马鱼也常用来研究鱼类对温度变化的适应机制。课题组前期通过甲基化DNA免疫共沉淀测序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,Me DIP-Seq)的方法发现斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4在低温驯化过程中,DNA甲基化水平发生了明显的改变,并且可能参与调控抗氧化、凋亡、发育、染色质修饰、免疫系统等与低温驯化相关的生物过程。通过比较低温驯化前后斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4的转录组数据,课题组发现低温压力导致斑马鱼细胞多种表观酶的表达都发生明显转变,包括组蛋白甲基化酶KMT2、KMT7,组蛋白去甲基化酶jmjd4、KDM4A、KDM6b,组蛋白乙酰化酶ep300,组蛋白去乙酰化酶HDAC8、HDAC11。另外,通过染色质免疫共沉淀(Chromatin Immuno-Precipitation,Ch IP)结合q PCR的方法也发现与寒冷适应相关的p53、selenbp1等基因启动子区域的组蛋白修饰也发生了转变。这表明DNA甲基化、组蛋白修饰确实参与了低温适应的过程。本研究通过RNA-seq和染色质免疫共沉淀结合高通量测序(Ch IP-seq)的方法来检测斑马鱼细胞ZF4在低温驯化前后lnc RNAs和组蛋白修饰在整个基因组的变化情况,进而探索lnc RNAs和组蛋白修饰在低温驯化过程中的调控机制。主要结果如下:1、为筛选鉴定斑马鱼中响应低温压力的lnc RNAs,本研究分别提取正常培养条件(28°C)和低温驯化(18°C 30天)后的斑马鱼胚胎成纤维细胞ZF4的总RNA进行高通量测序。重新组装转录本后,去除其中已知的m RNAs、lnc RNAs,并且去除长度小于200nt,开放阅读框大于300或具有编码潜能的转录本。按照如上标准鉴定出8363个新的lnc RNAs。在这些新的lnc RNAs中有62%定位在基因间区,27%定位在内含子区域。对这些新的lnc RNAs与已知m RNAs的一些特点进行比较,超过89%的lnc RNAs的外显子少于或等于2个,而超过86%的m RNAs的外显子都多于2个。超过70%的lnc RNAs的长度都要小于1kb,只有大约33%的m RNAs的长度小于1kb。lnc RNAs和m RNA的中位FPKM值分别为0.9和2.6。表明这些lnc RNAs外显子较少、长度较短、表达量较低。通过比较低温驯化前后lnc RNAs(包括新鉴定的lnc RNAs和已有注释的lnc RNAs)的表达谱,发现有347个lnc RNAs表达上调,342个lnc RNAs表达下调。这些差异表达的lnc RNAs与临近基因(假定的顺式靶基因)的表达大多都呈现出正相关关系。对这些临近基因中差异表达的部分进行基因本体(gene ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组的百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,GO富集结果显示显著富集的生物过程包括ATP合成耦合电子传递,细胞粘附,细胞迁移,氧化还原过程,横纹肌组织发育和多细胞生物体发育等,显著富集的KEGG通路包括氧化磷酸化、黏着斑、间隙连接、钙信号通路等。另外,根据lnc RNAs和m RNAs相互作用所需要的自由能,预测了差异表达最显著的20个lnc RNAs的反式靶基因,并根据相互作用构建了互作网络图。通过q PCR对差异表达的lnc RNAs和基因进行验证,q PCR结果与RNA-seq的结果显示出良好的一致性,说明RNA-seq数据是可靠的。另外,本研究也通过q PCR探索了低温驯化后的细胞在回复至正常培养条件之后,4个lnc RNAs和tp53基因的表达变化情况,结果发现在恢复至正常培养条件后,tp53基因的表达量又逐渐降低,在7天的时候已经与正常培养条件下的表达水平没有显著差异,MSTRG.2788.1也是7天恢复至正常水平,而NONDRET001625.2、MSTRG2629.2则在3天的时候就没有明显的差异。MSTRG.28882.1在7天的时候仍呈现出低表达的状态。这提示,不同的lnc RNAs可能受到调控的机制并不相同,它们恢复至正常水平所需要的时间也呈现出明显的差异。总的来说,低温压力导致斑马鱼细胞中的lnc RNAs的表达谱发生明显改变,本部分研究的结果为进一步探索lnc RNAs在鱼类适应低温压力中的作用奠定基础。2、为研究组蛋白修饰在参与斑马鱼应对低温压力时发挥的作用。该部分研究同样选用正常培养(28℃)和低温驯化(18℃30天)的斑马鱼细胞ZF4作为实验材料,使用针对H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac、H3K27me3等组蛋白修饰的抗体进行Ch IP-seq实验。通过生物信息学分析发现这几种修饰在低温压力下都发生了不同程度的变化,例如H3K4me3、H3K9me3总体水平降低,而H3K27ac、H3K27me3总体升高;经过低温驯化后H3K4me3、H3K27ac、H3K27me3在基因启动子区域的峰的比例都有所下降,而H3K27me3下降的最为明显,其富集度降低的位点中,启动子区域的比例超过了50%,富集度升高的位点在启动子区域的比例不到10%。基因集富集分析(Gene set enrichment analysis,GSEA)结果显示H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac与基因表达呈明显的正相关,而H3K27me3与基因表达呈负相关。表明这些组蛋白修饰确实参与了低温压力的基因表达调控。通过比较各染色体上基因表达水平和差异富集组蛋白修饰的分布,我们发现4号染色体长臂表达量明显偏低,而且在低温处理之后这些基因的表达水平整体出现降低。Chip-seq数据显示,该区域明显缺失H3K4me3与H3K27ac,并且H3K9me3、H3K27me3出现富集,呈现出异染色质化的状态。在低温处理之后,H3K4me3、H3K9me3与H3K27ac富集度整体下降,而H3K27me3出现升高。提示该区域整体基因表达下调受到组蛋白修饰的调控。为验证Ch IP-seq实验的准确性,分别在kdm4aa、tnfb、ccnd2a等基因的启动子和基因上设计引物,通过Ch IP-q PCR进行验证。验证结果显示Ch IP-q PCR与Ch IP-seq结果一致。对可能受到差异富集的这四种组蛋白修饰近距离调控的基因进行GO和KEGG富集分析。结果显示这四种组蛋白修饰所对应的生物过程或者通路只有较少的重叠,这提示不同的组蛋白修饰可能受到不同的转录因子的调控。GO富集结果显示:H3K4me3富集度降低的区域所在的基因大都和离子运输相关,H3K4me3正调控的生物过程包括核小体组装、染色质沉默、防御革兰氏阳性菌等;H3K27ac下调相关基因所涉及的生物过程包括负调控细胞迁移、正调控细胞增殖、MHC介导的抗原处理等,H3K27ac上调相关基因所涉及的生物过程大都和核糖体生物发生相关;受H3K27me3调控的基因大都和发育相关,另外它也参与了血管发生过程;受H3K9me3调控的基因也大都和发育相关,另外它也参与调控离子稳态、蛋白质泛素化等过程。4种组蛋白修饰参与调控的通路包括MAPK信号转导通路、Fox O信号转导通路、p53信号转导通路等,在很多斑马鱼冷压力相关研究中也观察到这些通路相关基因表达水平发生变化。通过观察H3K27ac调控的基因所在的通路发现,虽然H3K27ac升高可能增强了p53信号通路的激活,但是凋亡相关通路中多个基因(casp3a、casp7等)启动子区域的H3K27ac水平却出现下降,而且这些基因表达水平也大都呈现出下降趋势。这可能是斑马鱼细胞在抑制细胞增殖的同时又抑制凋亡,从而适应低温环境的一种方式。根据典型增强子和超级增强子所具有的组蛋白修饰特点,本研究也分别预测了与冷驯化相关的典型增强子和超级增强子。通过比较两类增强子临近基因的表达变化,我们发现超级增强子具有更强的影响基因表达的作用。通过对超级增强子的靶基因(距离增强子最近的基因)进行GO和KEGG富集分析来探索远距离的基因表达调控所涉及的生物功能。结果发现显著富集的生物过程包括以DNA为模板的转录调控、体节发生、血管发生、淋巴管发生等,显著富集的通路包括MAPK信号通路、斑点黏连、VEGF信号通路、Wnt信号通路等。血管发生相关基因增强子元件位置的H3K27ac富集水平升高,而H3K27me3的富集水平却出现下降。提示斑马鱼可能通过调控这两种组蛋白修饰来激活VEGF信号转导通路,促进血管发生,增强氧气扩散,以满足低温压力下的氧气需求。该部分研究揭示了组蛋白修饰在斑马鱼冷驯化中的潜在作用,完善了表观遗传在斑马鱼冷驯化中的调控机制,为下一步深入探索表观遗传在鱼类冷驯化中的作用和调控机制奠定基础。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

原理图,衍生技术,增强子,原理

图 1-1 3C 及其衍生技术原理Figure 1-1. Principles of 3C and its derivative technology4.5 增强子研究的应用基因或者增强子的易位与反转可能会导致异常的增强子与启动子的接触，进可能引发异常的表型，如人类疾病。比如前脑无裂畸形的病人中出现 SHH 位点

工作流程图,工作流程,转录本,数目

图 2-1 新 lncRNAs 的鉴定和特点分析（A）鉴定 lncRNAs 的工作流程。括号中的值显示的是转录本的数目。（B）新 lncRNAs 在基因组上的分布。（C-E）mRNAs 和新 lncRNAs 之间外显子数目、转录本长度和表达水平的比较。Figure 2-1. Identification and characterization of lncRNAs. (A) Workflow for identification oflncRNAs. The value in parentheses shows the number of transcripts. (B) The distribution of novellncRNAs on whole genome. (C-E) Comparison of exon numbers, transcript lengths, and expression

网络图,靶基因,生成热,互作

轴突延伸和启动子区域 RNA 聚合酶 II 的转录调节等；富集到的信号通路包括 Wnt 信号转导通路，ECM-受体互作，叶酸碳单位以及抗生素的生物合成等。为了更好的展现 lncRNAs 和反式作用 mRNAs 的互作，我们将自由能小于-50的 lncRNAs 和 mRNAs 挑选出来绘制出互作网络图。图 2-3D 显示出个 lncRNA可能调控多个靶基因而个靶基因也可能受多个 lncRNAs 的调控。

【参考文献】