凋亡调节蛋白BIM在金鱼鳃形态重塑中的作用

发布时间：2020-07-28 17:46

【摘要】：Bim是Bcl-2凋亡蛋白家族中仅有一个BH3同源结构域的蛋白,能够和Bcl-2家族中一些促生存亚家族成员如Mcl-1、Bcl-2、Bcl-xL结合,中和其活性,因此Bim被称作Bcl-2家族促生存成员的死亡配体,Bim和Bcl-2促生成蛋白因子的比例与Bim诱导凋亡有关。此外Bim蛋白还能够上调Bax亚家族促凋亡蛋白水平。在哺乳动物中,Bim前体mRNA由于不同的剪接方式会形成三种亚型:即 BimS(Bim short)、BimL(Bim long)、BimEL(Bim extra long)。一般情况下,BimEL含量最高,BimS含量最少,但是BimS促凋亡活性最强。金鱼(Carassius auratus),属于鲤科鱼类,早在南宋时期就作为观赏鱼类饲养。金鱼是低氧耐受能力最强的淡水鱼类之一,具有鳃形态重塑等独特的低氧适应机制。在缺氧、温水甚至运动状态下,金鱼鳃间嵌入式细胞团(InterlamellarCell Mass,ILCM)减少,使鳃表面积增加,从而显著增加对水体中溶解氧的吸收能力。在鲫鱼和金鱼中发现的鳃形态的可塑性后,一些鱼类可逆地重塑鳃形态的能力己经成为研究重点。HIF-1α通常被认为是许多低氧诱导反应的主要开关,在缺氧环境中HIF-1α稳定且表达升高。多种miRNA具有抑制细胞凋亡的作用,miR-24就是其中之一,并且miR-24的表达受低氧诱导因子HIF-1α的诱导,而Bim是miR-24下游的一个靶基因。目前,金鱼ILCM凋亡分子机制尚不明确,研究Bim基因对金鱼适应低氧和高温环境中ILCM凋亡机制的影响,对阐明金鱼适应低氧与高温的作用机理具有重要的意义。另外,对金鱼鳃形态可逆性重塑的研究,为通过基因工程培育抗逆性强的水产养殖新品种提供有益思路。为了探究Bim基因对金鱼鳃间ILCM细胞凋亡作用,本研究主要运用DNA重组技术、荧光定量PCR、Western Blot和RNApull-down等实验技术展开研究,具体内容如下:1.金鱼Bim基因克隆及抗体制备PCR克隆金鱼Bim基因编码区序列,获得两条长度为546bp和213bp的Bim CDS区序列,编码蛋白分别为182、71个氨基酸,推测是由于Bim基因不同的剪切形式形成的两种Bim亚型。通过对金鱼、斑马鱼和人的Bim氨基酸序列比对,选择肽链“VARELRRIGDEFNRLYC”作为制备金鱼Bim特异性抗体的抗原决定簇,成功获得特异性的Bim抗体。利用3'RACE技术扩增出长2952bp的Bim 3'-UTR序列,并构建pGEM-T-Bim-3'-UTR载体,序列分析表明金鱼Bim mRNA 3'UTR 区包含 9 个富含 AU 的元件(AUUU～UA,AU-rich elements,AREs)。2.miR-24及Bim在金鱼低氧适应中的差异性表达分析取健康金鱼随机分组,每组6条,分常氧组(溶氧量为8.5～9.5ppm)、低氧组(溶氧量1.8～2.1ppm)、低氧ERK抑制剂组培养8h后,解剖取样。取鱼鳃组织用戊二醛固定,经过脱水与干燥后,用超景深显微镜观察发现,与常氧条件相比,低氧条件下金鱼鳃间ILCM明显减少,而12.5 mg/kg ERK抑制剂处理可部分抑制低氧条件下金鱼鳃间ILCM细胞团的减少。荧光定量PCR分析表明,低氧能显著提高金鱼miR-24表达水平,同时金鱼鳃组织中BimmRNA水平无显著差异。Western Blot实验检测Bim蛋白表达情况,低氧条件下,Bim蛋白表达量较常氧处理组下降,注射ERK抑制剂导致Bim蛋白水平显著上升。由此推测,在低氧环境中miR-24的过表达和ERK1/2激酶的激活降低Bim的蛋白水平,从而促进金鱼ILCM细胞团的减少,ERK抑制剂处理可抑制低氧诱导的Bim蛋白水平的降低,和金鱼鳃组织ILCM细胞团的减少。3.金鱼温度胁迫中Bim表达分析及RNAPull-down分析取健康金鱼随机分组,分别设置温度为10℃、17℃、25℃的培养组,每组6条,培养24h后,解剖取样。荧光定量PCR分析表明,随着温度升高,BimmRNA和蛋白相对表达水平降低。为进一步探索不同温度影响Bim mRNA水平的原因,我们采用RNApull-down法分析不同温度对热休克蛋白HSC70和HSP40与Bim mRNA结合的影响。我们克隆出了金鱼HSC70和HSP40基因并构建原核表达载体pET32a-HSC70 和 pET32a-HSP40,通过 IPTG 诱导原核表达获得 Trx-HSC70 和 Trx-HSP40重组蛋白。用Sal Ⅰ限制性内切酶对pGEM-T-Bim-3'-UTR进行单酶切得到线性Bim 3'-UTR DNA,通过体外转录和生物素标记获得Biotin-Bim-3'-UTR RNA,亲和素树脂富集Biotin-Bim3'-U,RNA后,向树脂中加入等量要检测的Trx-HSC70 或 Trx-HSP40 蛋白,分别置于 10℃、17℃、25℃摇床上孵育 3h。Westem blot分析不同温度下HSC70与Biotin-Bim3'-UTR RNA结合能力的差异。在HSP40蛋白协同作用下,在一定范围内,温度越高,HSC70蛋白结合BimmRNA3'-UTR区的能力越弱。表明高温降低了 HSC70蛋白与Bim mRNA 3'-UTR区的结合水平,从而抑制了 HSC70对Bim mRNA的稳定作用,这也与25℃处理下Bim蛋白水平的降低吻合。本研究表明低氧与高温分别通过ERK/miR-24和HSC70/HSP40抑制Bim的表达水平,并诱导金鱼鳃组织ILCM细胞团的减少。Bim同时具有促进细胞凋亡和促进细胞生存的双重调节功能,推测在金鱼ILCM细胞团中Bim主要发挥促细胞生存作用。Bim双重调节功能的具体作用机制可能与特定细胞类型有关,还需要进一步的研究。
【学位授予单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4
【图文】：

丝裂原活化蛋白激酶（ＭＡＰＫ）途径是细胞增殖和存活的关键调节剂。该途逡逑径是由ＲＡＦ、ＭＥＫ邋（ＭＡＰ－ＥＲＫ激酶）和ＥＲＫ邋（细胞外信号调节激酶）激酶组逡逑成的三级激酶级联反应（图１．２）。在正常细胞中，ＲＡＳ激活ＲＡＦ激酶，活化的逡逑ＲＡＦ依次磷酸化并激活ＭＥＫ１和ＭＥＫ２，ＭＥＫ１和ＭＥＫ２在激活后磷酸化ＥＲＫ１逡逑６逡逑

３．１金鱼鳃组织总ＲＮＡ提取逡逑ＲＮＡｉｓｏ邋Ｐｌｕｓ提取金鱼鳃组织总ＲＮＡ，邋１％琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ提取质逡逑量（如图２．１）。从图中可以看出１８ＳＲＮＡ条带明亮清晰，５ＳＲＮＡ的条带较暗，逡逑说明提取的ＲＮＡ完整性好，降解程度低，可用于后续基因克隆实验。逡逑图２．１金鱼鳃组织ＲＮＡ提取逡逑Ｆｉｇ．２．１邋Ｔｏｔａｌ邋ＲＮＡ邋ｆｒｏｍ邋ｇｉｌｌ邋ｏｆ邋ｇｏｌｄｆｉｓｈ逡逑３．２金鱼Ｂｉｍ基因ＣＤＳ区序列克隆逡逑３．２．１邋Ｂｉｍ邋ＣＤＳ序歹丨Ｊ扩增逡逑以金鱼ｃＤＮＡ为模板，用引物ＢｉｍＳ－Ｆｌ、ＢｉｍＳ－Ｒｌ进行第一轮扩增，以ＢｉｍＳ－逡逑Ｆ２和ＢｉｍＳ－Ｒ２为引物进行第二轮ＰＣＲ（图２．２ａ），邋ＢｉｍＳＦ４－ｌ和ＢｉｍＳＲ４－ｌ用于最逡逑１９逡逑

逡逑后一轮ＰＣＲ扩增，结果如图２＿２ｂ，在５００ｂｐ和３００ｂｐ附近均有明亮条带，这可逡逑能与Ｂｉｍ基因有几种亚型相关，将两条明亮条带额分别割胶回收，为接下来构逡逑建克隆载体做准备。逡逑ａ逦ｂ逡逑，~T％~枺担埃埃猓椋惧錡＾}鑛 ｆｔ邋．邋．逡逑ｉ000ｂｐ＾＾Ｓ＾｜逡逑７５０ｂｐ逦，００ｂｐ逡逑＾ｓｏｂｐ逡逑图２．２金鱼Ｂｉｍ基因ＣＤＳ区扩增逡逑Ｆｉｇ．２．２邋Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｂｉｍ邋ＣＤＳ邋ｉｎ邋ｇｏｌｄｆｉｓｈ逡逑（ａ）ＢｉｍＣＤＳ邋区巢式邋ＰＣＲ邋第二轮，Ｍ：邋ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１：以邋ＢｉｍＳ－Ｆ２邋和邋ＢｉｍＳ－Ｒ２逡逑为引物扩增；（ｂ）ＢｉｍＣＤＳ邋区巢式邋ＰＣＲ邋最后一轮，Ｍ：邋ＤＬｌＯＯＯＤＮＡＭａｒｋｅｒ；邋１：以邋ＢｉｍＳ－逡逑Ｆ４和ＢｉｉｎＳ－Ｒ４为引物扩增逡逑（ａ）Ｓｅｃｏｎｄ邋ｒｏｕｎｄ邋ｏｆ邋ｎｅｓｔｅｄ邋ＰＣ＆邋Ｍ．．ＤＬ２０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；邋１：邋Ｂｉｍ邋Ｓ－Ｆ２／Ｓ－Ｒ２邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ逡逑ｆｏｒ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；邋（ｂ）Ｔｈｅ邋ｆｉｎａｌ邋ｒｏｕｎｄ邋ｏｆ邋ｎｅｓｔｅｄ邋ＰＣＲ，邋Ｍ：ＤＬ１０００邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ；ｌ：邋Ｂｉｍ邋Ｓ－Ｆ４／逡逑Ｓ－Ｒ４邋ｐｒｉｍｅｒｓ邋ｗｅｒｅ邋ｕｓｅｄ邋ｆｏｒ邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ逡逑１２．２邋Ｂｉｍ－ｐＭＤ邋１９丁克隆载体构建逡逑将割胶回收的５００邋ｂｐ左右的目的片段命名为Ｂｉｍｉ，３００邋ｂｐ片段命名为Ｂｉｍ２，逡逑将两个片段分别连接到ｐＭＤ１９Ｔ邋ｅａｓｙ载体上

【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 秦佳;杨金莹;伊淑莹;刘箭;;热激蛋白对细胞凋亡的调节作用[J];生命科学;2007年02期

本文编号：2773234