罗非鱼源无乳链球菌特异性卵黄抗体的制备及其活性研究

发布时间：2020-07-30 00:53

【摘要】：全球水产业每年因无乳链球菌(SStreptococcus agalactiae/group B Streptococcus,GBS)病的流行性暴发造成了惨重的经济损失,罗非鱼是GBS的易感宿主之一,而近年来引起我国养殖罗非鱼暴发该疾病的GBS又以Ia型为主。人们通常使用抗生素对罗非鱼GBS病进行防治,随着抗生素带来的问题日益严重,人们开始研制或者找寻更有效、更安全的新型药物来替代抗生素。在寻找抗生素替代品的过程中,卵黄抗体(immunoglobulin of egg yolk,IgY)由于生物学上不激活补体,不与Fc受体和人类风湿因子结合,可与异源抗原上的更多表位发生反应等高特异性优势；以及制备上成本低、产出率高、提纯简便快捷,并具有耐酸碱、稳定性好等优点,引起了许多研究人员的兴趣。本研究以I。型菌株GBS/HN0303为抗原免疫蛋鸡,采集免疫蛋；采用氯仿法与饱和硫酸铵盐析法结合的方式制备特异性IgY。运用玻片凝集试验、免疫印迹(WB)、细菌特异性染色、酶联免疫吸附试验(ELISA)与试管凝集试验等方法,从定性到定量,对所得IgY抗体特性、在蛋鸡体内免疫应答情况及其理化性质进行检测；并通过／.外抑菌与体内抗病试验对其抗菌效果进行评价。1.IgY制备效果及理化性质本研究以1×109CFU/mL菌液制成的全菌灭活疫苗,可引起蛋鸡较好的免疫应答,经过四次免疫后,鸡蛋中的IgY可以达到较高的浓度；经间接ELISA测定,鸡蛋中IgY抗体水平峰值出现于四免后第48d,可以达到1：100000,并可维持至少一个月时间。通过玻片凝集、特异性染色及免疫印迹等试验,证明sp-IgY具有较高结合活性；另外在低温环境下储存IgY活性稳定,且在pH3-7范围内,IgY抗体活性良好。2.IgY的体外抑菌能力在液体环境中,sp-IgY的抑菌效率明显,28℃下孵育,500μg/mL的sp-IgY可成功抑制等体积1×105CFU/mL的GBS/HN0303生长达12h：在固体培养条件下,sp-IgY抑菌效果与其特异性组分含量正相关,含量越高,抑菌效果越佳,呈现出明显的量效关系；还证明了sp-IgY在鱼体内对GBS/HN0303具有中和能力。3.IgY的体内抗病能力以罗非鱼为模型动物,检验了所制备IgY的防治功效。总体上,都表现出了对罗非鱼免疫增强的作用,具体体现为攻毒后延缓罗非鱼发病进程,其中sp-IgY组较对照组有效降低了累计死亡率,表现出了其具有特异性抗病能力；而将sp-IgY拌料口服免疫时,随着饲料中sp-IgY含量的升高,其免疫保护率亦随之上升,最高免疫保护率可达46.7%,证实sp-IgY在体内发挥抗病作用时,依旧存在量效关系。综上所述,本研究制备的罗非鱼源GBS特异性IgY具有一定保护作用,可将其作为一种新型的罗非鱼抗菌免疫制剂。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S948
【图文】：

结构示意图,重链,分子量,碳氨

逦ｙ逡逑ｉ％邋Ｉ逦Ｉ家兔１逡逑图１．１脊椎动物进化谱ｉｗ逡逑Ｆｉｇ邋１．１邋Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ逡逑２N２邋ＩｇＹ的结构和功能逡逑最初，人们认为ＩｇＹ与ＩｇＧ相似，然而现在人们发现它是哺乳类动物ＩｇＧ、逡逑ＩｇＥ甚至包括ＩｇＡ的前体蛋白。虽然禽类ＩｇＹ在功能上与哺乳类动物ＩｇＧ差异不逡逑大，在结构上却差异很大。ＩｇＹ分子的一般结构与ＩｇＧ分子相同，都由两条重链逡逑（Ｈ）和两条轻链（Ｌ）构成，从分子量上比较，ＩｇＹ分子量（１８化Ｄａ）与ＩｇＹ重逡逑链分了量（６７－７０ｋＤａ）分别比ＩｇＧ的分子量（１５化Ｄａ）与ＩｇＧ重链分子量（５化Ｄａ）逡逑大。这是由于ＩｇＹ重链恒定结构域与相应的区域间碳氨链的数量有所增加，ＩｇＧ逡逑仅有３个保守区域（Ｃｙ１－Ｃｙ３），而ＩｇＹ有４个（Ｃ丫邋１－Ｃｙ４）邋ｗｎ邋（如图１．２）。从逻逡逑辑上分析，由于ＩｇＹ分子较之ＩｇＧ分子的重链多出了邋一个保守区域Ｗ及其相应的逡逑区域间碳氨链的分子量，所Ｗ形成了上述结果。ＩｇＹ在结构上与ＩｇＧ相比较，还逡逑有其它一些不同之处

分离液,提取液,对照组,蛋鸡

抗体制备情况见表２．４，蛋鸡免疫后，试验组１５羽蛋鸡共采得鸡蛋９０７枚，平均每逡逑周期３２．３９枚，鸡日均产蛋０．７２枚；对照组５羽蛋鸡共采得鸡蛋３４９枚，平均每周期１２．４６逡逑枚，鸡日均产蛋化８３枚。抗体制备各步骤纯度检测结果见图２．１。由图可知，饱和硫逡逑酸辕盐析分离的液体，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳后形成两个明显条带，分子量分别约为；６６ｋＤａ逡逑和２８ｋＤａ，该两条带分别对应ＩｇＹ的重链和轻链，显示出了该方法制备产物中的ＩｇＹ纯逡逑度较高。逡逑表２．４抗体制备情况图逡逑Ｔａｂ邋２．４邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋化ｅ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ逡逑＾验组逦对照组逦￣逡逑提取液总体积（ｍＬ）逦２％＂７５邋（９０７枚）逦８７２５邋（３４９枚）逡逑提取液平均浓度（ｍｇ／ｍＬ）逦１０．５４１逦１０．５４９逡逑蛋平巧水溶性组分含量（ｍｇ）逦２６３．５２５逦２６３．７２５逡逑分离液总体积（ｍＬ）逦５４００邋（９０７枚）逦２０００邋（３４９枚）逡逑分离液平均浓度（ｍｇ／ｍＬ）逦１３．４３１逦１４．７８４逡逑蛋平均分离液含量（ｍｇ）逦７９．９６４逦８４．７２２逦逡逑Ｍ邋１逦２逦Ｍ邋３逦４逡逑ｋＤａ邋秦．‘。ｋＤａ逦ＶＳ邋Ｋ逡逑９７．２逦}0岕ｒ邋Ｗｍ．逦９Ｔ．２，ｍｍｒ邋ＷＭ逡逑６６．４逦ｍ逦６６．４邋髓逦ｌＵｆ逡逑４４．３逦瓣逦４４．３邋ｆｉｆ逡逑９０邋（＼逦那卿－２９．０邋ｍｍｍ邋．逦—逦￣＇…Ｊ逡逑＇兮．私岕＊＂＾＾逦揓＇：‘Ｖ游巧巧巧逡逑＇邋－逦曲

凝集试验,细菌细胞

Ｆｉｇ邋２．２邋Ｔｈｅ邋Ｋｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ａｇｇｌｕＵｎａｔｉｏｎ邋ｔ：ｅｓｔ逡逑染色逡逑出，经过细菌特异性染色后，ｓｐ－ＩｇＹ组（图２．３－NB图２．３－Ｂ左）与空白姐（图２．３－Ｃ左）则未显色，镜染之后，每沮都可见均质红染的细菌细胞（图２．３－Ａ对ＧＢＳ／ＨＮ０３０３具有特异性结合能力。逡逑５．１逡逑．采x锿兀豪杳位Α叮危渝澹靛危惧危诲危危义希掊危涣顧乏邋＊彟邋＾逦、）逡逑！？邋Ａ，邋；逦！邋Ｓ邋＆．嗦刦逡逑４＇邋’％％换；，二禾产私}sＪＩ逡逑＊鲁泌复＊

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