拟穴青蟹抗菌肽Crustin的表达特性及其抗菌机制的研究

发布时间：2020-07-30 05:08

【摘要】：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国东南沿海重要的海水养殖蟹类,养殖过程中持续遭受病原微生物的感染。抗菌肽(Antimicrobial peptide)是青蟹先天免疫系统中的重要效应分子,其具有的广谱抗菌活性、不易产生耐药性等特性使其成为传统抗生素的替代者之一。Crustins是目前蟹类中研究比较广泛的一类抗菌肽,为揭示青蟹抗菌肽Crustin的功能,本论文选取SpCrus5(GenBank登录号MF431586)和SpCrus6(GenBank登录号MF431585),利用体外重组表达或肽段合成方式,确定抗菌谱和抗菌活性,揭示其杀菌机制。实验结果如下:(1)联合多肽Scy-SpCrus5的真核重组表达及抗菌活性:构建pPIC9K-Scy-SpCrus5真核表达载体,转入毕赤酵母(Pichia Pastoris)GS115进行诱导表达,结果显示,甲醇诱导浓度0.5%,28oC下培养24 h时表达联合多肽Scy-SpCrus5。大量表达后采用镍柱亲和层析纯化,将获得的目的抗菌肽进行体外抗菌活性研究。结果表明,15μM下重组表达的联合多肽,对所选的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌无明显的杀菌作用。(2)Scy-SpCrus5对金黄色葡萄球菌的作用机制:联合多肽Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌共孵45 min,共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察抗菌肽与微生物互作后的定位情况,结果显示,联合多肽Scy-SpCrus5可作用于金黄色葡萄球菌细胞表面,而Scygonadin处理下(对照组)无该现象;进一步酶联免疫吸附试验(ELISA)实验研究Scy-SpCrus5与金黄色葡萄球菌细胞壁组分的结合情况,结果显示,在浓度0.5μM时,联合多肽Scy-SpCrus5即可结合脂磷壁酸(Lipoteichoic acid,LTA),且结合效率与蛋白浓度呈正相关。(3)SpCrus6_(29-47)抗菌活性及杀菌动力学曲线:生物信息学分析并预测SpCrus6_(29-47)具有抗菌活性,体外合成肽段SpCrus6_(29-47)进行抗菌活性实验,革兰氏阳性菌中,对谷氨酸棒状杆菌、藤黄微球菌、溶壁微球菌、金黄色葡萄球菌有较强的杀菌作用,最小抑制浓度(Minimal inhibitory concentration:MIC)为6~24μM;革兰氏阴性菌中,对荧光假单胞菌、施氏假单胞菌抑杀作用较弱,MIC为24~48μM,对大肠杆菌模式株、弗氏志贺氏菌无抗菌活性,MIC为48μM,结果表明,SpCrus6_(29-47)对革兰氏阳性菌有更强抗菌活性。杀菌动力学曲线实验结果显示,当SpCrus6_(29-47)与金黄色葡萄球菌共孵5 min时,杀菌指数为50%,共孵2 h后,杀菌指数达到100%。(4)初步揭示SpCrus6_(29-47)对金黄色葡萄球菌的杀菌机制:当合成肽SpCrus6_(29-47)与金黄色葡萄球菌共孵45 min时,扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察到细菌细胞表面粗糙,表面结构崎岖不平,出现大量细胞碎片,而对照组细菌细胞光滑、完整、细胞形态未改变。透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)观察到细胞质膜破裂,甚至完全消失,细菌周围出现碎片,而对照组细菌细胞质膜完整,膜结构清晰可见且连续。流式细胞仪分析SYTO 9/PI的摄入情况,结果显示,SpCrus6_(29-47)处理后的金黄色葡萄球菌对荧光染料PI的摄入量明显增多,揭示SpCrus6_(29-47)可以改变金黄色葡萄球菌细胞质膜的通透性。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S945

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