基于组学的刀鲚群体产卵不同步分子机制研究

发布时间：2020-07-30 10:53

【摘要】：刀鲚轿(Coilianasus),隶属鲱形目、提科、鲚属,俗称刀鱼,是长江中珍稀名贵的生殖洄游性鱼类,以鲜、嫩、美而闻名,享有“长江三鲜”之首的美誉。随着刀鲚养殖技术的逐步推广和苗种增殖放流技术的成熟,对苗种的需求量日益增大,迫切需要解决刀鲚规模化苗种繁育技术。然而,刀鲚群体产卵的不同步性和强烈的应激反应严重制约了规模化人工育苗技术的进一步发展。本项目针对刀鲚群体卵巢发育不同步的现象,在系统阐明池养刀鲚产卵规律的基础上,运用基因组、转录组和代谢组学的整合化研究手段,筛选刀鲚卵巢发育的重要信号传导通路和关键调控基因,解析其群体产卵不同步的机理,同时结合人工催产技术探索外源激素调控卵巢发育的规律,旨在建立一套促使刀鲚卵巢发育同步化的方法,为实现刀鲚的规模化人工繁殖提供科学依据。主要研究内容如下:1、刀鲚亲鱼强化培育及自然产卵规律研究试验研究了人工饲养条件下刀鲚亲鱼培育的水温及主要水化学指标、饵料投喂策略及经强化培育后刀鲚自然产卵的规律。结果表明,刀鲚亲鱼培育池周年水温变化范围为5℃-34℃,刀鲚亲鱼常年摄食,采用“鲮鱼鱼苗+细足米虾”的系列活饵进行饲育期、越冬期、促熟期分阶段的强化投喂策略,雌性亲鱼强化培育后成熟系数可达16.5%,发育较佳,总体成活率为97.6%。刀鲚群体产卵不同步性现象明显,产卵持续时间长,从4月下旬至7月下旬均产卵,5-6月是刀鲚产卵的高峰期,产卵时间集中在20:00-20:30,受精率为80.0%-92.0%,刀鲚的产卵与水温关系密切,最适产卵水温为20.0℃-28.0℃。本试验中,刀鲚亲鱼培育的营养(充足食物来源)、水体环境完全一致,但其群体性腺发育依然呈现显著的不同步性,与史载的“长江刀鲚产卵从四月中、下旬开始,一直延续到十月份”相似,表明,刀鲚群体产卵不同步性主要是遗传因素造成。2、刀鲚全基因组的测序、组装与注释采用经典的鸟枪法测序策略及Hiseq 2500测序平台进行了刀鲚全基因组的测序,完成了刀鲚基因组denovo组装。同时,注释了刀鲚基因位点、开放性阅读框架、鉴定起始子、终止子、内含子、外显子区域、可变剪切位点以及蛋白质编码序列等基因结构和结构域、蛋白质功能及所在的代谢通路等信息的基因功能并分析了其进化特征。结果显示,刀鲚基因组文库测序共产生277.92GB的数据量,经过滤后,得到大小为181.74GB的高质量序列数据。在17-mer条件下,估算刀鲚的基因组大小为714Mb,杂合度较高,达到1.04%。结果组装出的Contigs的总数目为84691个,片段长度大于2kb的数量为59201个,N50长度约为19.0kb,最长的Contig长度约为230kb。组装的Scaffolds数量为1159个,N50长度约为1.8Mb。Scaffolds的总组装长度约为786Mb,为基因组预测大小的1.1倍。刀鲚基因组GC含量主要分布在18.6%-79.8%之间,最大峰值为44.2%,符合正态分布,证明刀鲚基因组的测序过程中未受到外部污染。刀鲚基因组的平均测序深度为258X,最大的碱基覆盖深度为300×,覆盖深度小于10所占的比率低于5%。刀鲚重复序列的总长度为约245.66Mb,占基因组的31.24%。通过刀鲚转录组序列比对,经GLEAN整合的刀鲚编码基因数为20,353个。通过InterPro、GO、KEGG、Swissprot及TrEMBL5大注释平台找出了功能明确的刀鲚基因总数为18,547个,占刀鲚基因总数的91.13%;仅有8.87%的基因无法在目前已知的数据库中找到其相应的功能,属于刀鲚的特有基因。进化上,刀鲚属于硬骨鱼的鲱形亚部(Clupeocephala),与电鳗目的电鳗(Electrophoruselectricus)和鲤形目的斑马鱼(Daniorerio)的亲缘较近,而同为鲱形目的大西洋鲱(Clupeaharengus)在较早的时间与刀鲚分化。可见,鲱形目内部分化比较明显,这可能是造成鲱形目与耳鳔系关系存在争议的重要原因,鲱形目和耳鳔系不能分别成为单系。3、基于转录组和代谢组整合技术的刀鲚卵巢发育不同步研究为了揭示刀鲚卵巢发育不同步性的调控机制,针对同一时间,发育Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ期的卵巢,运用转录组和代谢组整合化分析的方法,筛选调控刀鲚卵巢发育不同步的关键信号通路。结果显示,共获得565个代谢物和47049个Unigene。在卵巢Ⅲ到Ⅳ发育过程中,55个代谢物和830个Unigene显著上调,27个代谢物和642个Unigene显著下调;卵巢Ⅳ到Ⅴ期发育过程中,31个代谢物和1932个Unigene显著上调,4个代谢物和764个Unigene显著下调。通过对差异代谢物和基因的共富集分析,发现43条通路在卵巢Ⅳ到Ⅴ期发育过程中发挥重要作用,50条通路在卵巢Ⅳ到Ⅴ期发育过程中发挥重要作用。其中,39条在卵巢Ⅲ到Ⅴ期发育过程中一直发挥着重要作用。经以上通路的代谢物和基因进行互作分析,发现了 3条调控刀鲚卵巢发育不同性的核心通路,分别是角鲨烯和胆固醇合成通路、类固醇激素合成通路和花生四烯酸代谢及前列腺素形成途径。4、刀鲚前列腺素E2基因克隆及调控表达前列腺素E2(PGE2)具有多种生物活性,参与各种生理过程,由3个连续的酶促反应生成,其中前列腺素E合酶将PGH2异构化为PGE2是关键步骤。PTGES2基因是花生四烯酸代谢及前列腺素形成通路中的关键基因,在刀鲚卵巢发育不同步性调控中发挥重要功能。结果显示,刀鲚PTGES2基因存在2个拷贝,将其分别命名为PTGES2a和PTGES2B。PTGES2a cDNA全长1575bp,阅读框1167bp,编码388个氨基酸,5'和3'非编码区分别为269bp和139bp。DNA全长为3,222bp,包含7个外显子和6个内含子。PTGES2b cDNA全长1457bp,开放阅读框729bp,编码242个氨基酸,5'和3'非编码区分别为402bp和326bp。DNA全长为1,908bp,包含6个外显子和5个内含子。荧光定量结果显示,PTGES2a在鳃和肝脏组织中高表达,而PTGES2b在鳃和精巢中高表达。在刀鲚性腺发育过程中,PTGES2a和PTGES2b表达模式相似,均显著下降;但在刀鲚的人工催产过程中,PTGES2a的表达量显著下降,而PTGES2b的表达量显著上调。以上结果表明,PTGES2a和PTGES2b均在刀鲚性腺发育早期发挥重要功能,而且PTGES2b在产卵过程中发挥重要作用。5、注射LHRH-A2对刀鲚的催产效果及其雌鱼血液生化指标的影响为了探明外源激素(LHRH-A2)对刀鲚的人工催产效果及其雌鱼血液生化指标的影响,通过对强化培育的刀鲚亲鱼注射LHRH-A2进行人工催产并分析人工催产效果;同时应用放射性免疫、化学发光等方法,对人工催产过程中刀鲚雌鱼的血液生化指标进行了系统研究。结果显示,按照刀鲚雌鱼30μg/kg、雄鱼减半的剂量注射LHRH-A2,刀鲚亲鱼死亡率为16.67%±3.34%;存活刀鲚亲鱼群体中,效应时间为21-24h,催产率为83.33%±3.34%,受精率为75.06%±6.19%。注射催产素21 h内,血浆中17β-雌二醇(E2)、催乳素(Prolactin)、甲状腺素(T4)、皮质醇、总蛋白(TP)、乳酸在人工催产过程表现出先上升后下降的规律;三碘甲腺原氨酸(T3)、甘油三酯(TG)、C1-呈现持续下降趋势;谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、渗透压、K+、Na+呈现持续上升的趋势。比较以上血浆指标在产卵组和未产卵组的结果显示,产卵组形成高皮质醇、总蛋白、甘油三酯、渗透压、钠离子、钾离子的血浆环境和低17β-雌二醇、催乳素、乳酸、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、氯离子、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的血浆环境,而未产卵组的这些指标与产卵组相反(P0.05)。结果显示,人工催产过程对肝脏、肾脏等正常功能造成了影响,从而抑制催产激素LHRH-A2对卵子的正向调控作用。表明,垂体-甲状腺-肝脏轴是刀鲚应激与生殖之间的桥梁,应通过适当的抗应激调控,降低应激损伤的影响,同时配合注射适宜浓度的甲状腺激素(TH),提高催产的成功率。
【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【图文】：

广泛分布于中国的长江、东海、韩国海域及日本有明海（Ｃａｂｒａｌ，２００８；邋Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ．邋Ｎｅｌｓｏｎ逡逑ａｎｄＷｏｎｇｒａｔａｎａ，１９８８；袁传宓等，１９７６；庄平等，２００６），俗称刀鱼，是长江中珍稀逡逑名贵的生殖洄游性鱼类，以鲜、嫩、美而闻名，享有“长江三鲜”之首的美誉（图１）。逡逑上世纪七十年代长江刀鲚的汛期捕捞量一度高达４１４２吨，曾占长江鱼类捕捞数量的逡逑３５％－５０％，“春食江鲂”成为重要的江南民俗；近年来，受水域生态环境恶化、过度逡逑捕捞和涉水工程建设等因素影响，长江刀鲚洄游群体数量急剧下降，己难以形成渔汛，逡逑“姿看收网见银刀”的年代一去不返。２００７年，刀鲚被列入首批“国家重点保护经逡逑济水生动植物资源名录”（中华人民共和国农业部公告第９４８号），２０１２年长江刀鲚捕逡逑捞量降至历史低点，仅为５７．５吨（徐跑等，２０１６）。目前，随着天然刀鲚资源量的锐逡逑减，长江刀鲚价格畸高不下，甚至出现“天价鲂鱼”的窘境，价格的上扬又进－步加逡逑剧了捕捞强度

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组整合技术的刀鲚卵巢发育不同步研宄；⑷刀鲚前列腺素Ｅ合成酶２的分子特征及逡逑其产卵应答模式；（５）注射ＬＨＲＨ－Ａ２对刀鲚的催产效果及其雌鱼血液生化指标的影响。逡逑采用的主要技术路线如图２。逡逑池养刀鲚产卵规律逡逑４逦，逦，逡逑不同发育期卵巢—逦￣刀鲚雌鱼逡逑逦逦ｒ＇逦逦逦、逦逦１逦逦逡逑：「７逦逦ｒ－￣逦＾逦．．邋／Ｉ逦－ｔ！逦逡逑：！逦ＧＣ－１Ｎ１Ｓ检测代谢全谱Ｉ逦１逦ＲＮＡ－Ｓｅｑ检测转录组ｊ逦：丨逦文库构建逦？？逡逑：Ｉ逦ｒ逦—＇！逦ｊ逦Ｔ逦」！逦；逦＝逦Ｉ邋逦邋ｉ逡逑：．ＪＬ．Ｉ邋数据前处理逦｜！逦！逦数据过滤逦ｉ逦：：逦数据采集逦；逡逑：代逦？逦！逦｜＾－｜逦？逦：逦；逦：逦Ｉ逦：逡逑ｉ谢￣化学计置学分析￣Ｉ；逦５逦Ｉ序列拼接与基因注释ｊ逦ｉ逦；逦数据过滤逦：逡逑啤丨邋＋逦，！邋１邋：逦＋逦；逦｜逡逑：！逦差异性代谢物逦１逦Ｙ逦差异基因表达逦ｊ逦！：逦组装注释逦ｉ逡逑！逦ｊ逦？逦！逦｜逦ｔ逦！逦：逦：逦ｆ逦：逡逑＼逦！＂＂＂＂代谢通路分析￣￣｜！

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Ｆｉｇ．３－１邋Ｇｅｎｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ邋ａｎｄ邋ａｓｓｅｍｂｌｙ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋Ｃｎｉｌｉａ邋ｎａｓｕｓ逡逑１．３基因组测序与组装流程逡逑通过Ｈ１Ｓｅｑ２５００测序仪对刀鲚基因组进行测序装分析主要流程为（图３－１）：⑴逡逑提取刀鲚的基因组，制备基因组的ＤＮＡ文库；⑵制备Ｆｌｏｗｃｅｌｌ毛细电泳管；⑶利用逡逑ＨｉＳｅｑ２５００自动分析平台进行边合成测序；⑷对测序结果进行过滤和筛选；⑶进行基逡逑因组的序列组装和组装评价。逡逑１．４邋ＤＮＡ文库的构建逡逑得到完整的刀鲚基因组样本后，将其打断分别构建了长度为２５０ｂｐ，５００ｂｐ，８００ｂｐ，逡逑２ｋｂ，邋５ｋｂ，１０ｋｂ，邋２０ｋｂ邋共邋７邋个个基因组邋ＤＮＡ邋文库。其中，２５０ｂｐ，邋５００ｂｐ邋和邋８００ｂｐ邋三逡逑个文库为小片段ＤＮＡ文库。小片段ＤＮＡ文库的构建方法为：逡逑（１）使用超声打断基因组ＤＮＡ；逡逑⑵使用Ｔ４邋ＤＮＡ聚合酶和聚合酶和ｋｌｅｎｏｗ聚合酶对ＤＮＡ邋ＤＮＡ进行末端修复，逡逑形成平进行末端修复，形成平末端；逡逑⑶在聚合酶的作用下，末端修复ＤＮＡ的３’末端被加上Ａ碱基；逡逑⑷配置Ｔ４邋ＤＮＡ连接酶反应体系，在Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ适温反应一定时间后，接头逡逑和加“Ａ”产物相连接；逡逑（５）对连接后的产物进行琼脂糖凝胶电泳

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