斑马鱼消化器官突变体的遗传筛选和Ubel蛋白的原核表达纯化及抗体生产

发布时间：2020-08-15 23:24

【摘要】：本研究论文由两个相对独立的部分组成：第一部分,斑马鱼消化器官突变体的正向遗传筛选；第二部分,斑马鱼Ubel蛋白的原核表达、纯化及抗体生产。故在此分别阐述：斑马鱼为小型亚热带淡水鱼类。长期以来,斑马鱼因其独特优势,成为研究脊椎动物胚胎发育的完美模型。斑马鱼易于饲养,并在三个月左右达到性成熟。雌鱼每周可产数百粒卵,胚胎透明且在母体外发育,非常适合作大规模遗传筛选。肠道和肝脏都发育自内胚层,然而,我们至今仍不清楚,这两种器官的发育分子机制有怎样的相似性和不同点。针对此问题,我们通过无基因差别的正向遗传筛选,获得肝脏和肠道缺陷的突变体,以探究对这两大器官发育有影响的突变基因。ENU因其高效和无位点偏好性的特点被用于本研究的诱变剂。收集3.5dpf斑马鱼胚胎用于全胚胎原位杂交实验,探针采用肠道特异标记ifabp和肝脏特异标记lfabp,根据表型结果统计和孟德尔遗传定律确定其父母是否为携带隐性突变的杂合突变体。筛选首先在F2代进行,具有一般性缺陷的疑似突变体被我们丢弃。为了排除因高突变背景造成的非遗传性突变表型,我们将F2的疑似突变体杂合子与野生型进行杂交,并在F3代中再次进行筛选。在对78个突变基因组进行筛选后,我们得到了源于22个F2家族的37个F3突变体。对这37个F3突变体进行分型,发现其中31个突变体的肝脏和肠道都有缺陷,4个“肠道特异性突变体”和2个“肝脏特异性突变体”分别表现出肠道或肝脏更加严重的缺陷表型。这些数据表明,斑马鱼中调控肝脏和肠道发育的因子大都是相似或相同的。对突变体的进一步研究,有望让我们对斑马鱼及其它脊椎动物消化器官发育的分子机制有更深的理解。泛素化修饰是ATP依赖性的过程,需要E1(泛素激活酶)、E2(泛素转移酶)、E3(泛素连接酶)三种酶共同完成。通常,单泛素化修饰改变底物蛋白的亚细胞定位或募集,而K48多泛素化修饰导致目标蛋白的降解,26S蛋白降解复合体识别多泛素化的底物,并将其去折叠、降解成小肽段。泛素化修饰通路对于真核细胞中大多数短周期性蛋白的降解是必需的,而且从酵母到哺乳动物都是保守的。泛素化修饰不仅对细胞的自稳态必不可少,而且对于许多人类疾病具有重大影响。由于泛素依赖性蛋白降解常常被用于调控细胞分裂周期和细胞生长,研究者们发现蛋白降解抑制因子可能被用于癌症和白血病等疾病的治疗。Ube1是泛素化修饰中起主要作用的E1,对于泛素链第一步反应必不可少,对细胞分裂、分化和机体稳态等重要途径具有十分重要的意义。基于Ube1的结构和生化研究,以及对泛素通路相关酶和蛋白的研究,都离不开高纯度的Ube1蛋白。首先,我们将斑马鱼ube1基因全长CDS序列克隆进pSUMO(pET28a-SUMO)表达载体,并转入E.coli BL21表达菌株,采用亲和层析的方式纯化Ube1蛋白。然而,考马斯亮蓝染色结果显示,纯化得到的蛋白样品中含有较高比例的杂蛋白。Western blot结果显示,其中杂蛋白大都为全长Ube1蛋白断裂的片段,在原核表达之初即存在,从而影响了后续的蛋白纯化。随后,我们改变策略,将Ube1蛋白碳端105个aa的编码核酸序列克隆进pET28a表达载体,并转入E.coli BL21表达菌株,采用亲和层析的方式纯化Ubel C'terminal短肽,结果得到了纯度较高的蛋白样品。以该蛋白样品为抗原、雄兔为实验动物,生产Ube1抗体。Western blot结果显示,生产的Ube1抗体工作好,且效价高。采用抗原抗体亲和纯化的方法,对上述Ube1抗体进行纯化,使得抗体特异性有了明显提高,且抗体回收率在25%以上。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【图文】：

突变体,后代,野生型,杂合

称为ｆｏｕｎｄｅｒ，与野生型杂交以产生Ｆ１代。Ｆ２家族由来自不同ｆｏｕｎｄｅｒ的Ｆ１鱼交配产生，而逡逑非通常的ｎ与野生型杂交（因ＥＮＵ诱变是随机的，一条Ｆ１上发生的某一特定突变，很难逡逑在来自另一邋ｆｏｕｎｄｅｒ的Ｆ１发生，故二者可互为野生型，从而提高蹄选效率）（图２．１）。此过逡逑程由西南大学罗凌飞教授实验室完成。逡逑（２）肝脏和肠道突变体的筛选（Ｆ２）逡逑我们将来自同一邋Ｆ２家族的斑马鱼随机交配以获取Ｆ３后代，在３．５ｄｐｆ时收集约４０颗胚逡逑胎，用于做原位杂交实验。根据孟德尔分离定律，若Ｆ３后代中有２５％左右表现出相同的缺逡逑陷，则其Ｆ２父母可被认定为携带隐性突变的杂合突变体（图２．１）邋？逡逑（３）突变体的传代和再蹄选（Ｆ３）逡逑将Ｆ２突变体与野生型杂交传代，产生的后代称为Ｆ３。与Ｆ２代筛选类似，Ｆ４胚胎被用逡逑于确定Ｆ３杂合突变体（图２．１）。逡逑（４）互补实验与突变体表型的分类逡逑若来自同一邋Ｆ２家族的ｎ突变体具有相似的表型，则需要将两者相互交配进行互补实逡逑验，如果后代产生２５％的突变表型，则可认为两者为相同突变体。最终确定的Ｆ３突变体，逡逑将会依据其表型特征被分为几种不同的类别。逡逑１１逡逑

序列,融合蛋白,分子量,载体

Ｆｉｇ．邋３．１邋Ｂｒｉｅｆ邋ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐＳＵＭＯ邋ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ逡逑ｐＳＵＭＯ载体以ｐＥＴ２８ａ为原型，在Ｍｅ／和及册限制性内切酶位点间插入编码ＳＵＭＯ逡逑蛋白（Ｓｎｉｔ３ｐ，ＮＰ＿０１０７９８）的基因。在ｐＳＵＭＯ载体中，图３．１所示蛋白表达区以Ｔ７邋ｐｒｏｍｏｔｅｒ逡逑启动表达。若以ｐＳＵＭＯ为原核表达载体，目的基因序列可插入Ｓａｃｌ，邋Ｓａｉｌ，邋Ｈｉｎｄｌｌｌ，逡逑Ｎｏｔｌ．邋ＡＴｗ厂多克隆位点之间。表达得到的目的蛋白Ｎ’端会带有６Ｈｉｓ标签和ＳＵＭＯ融合蛋逡逑白，导致其分子量增加１３邋ｋＤａ左右。ＳＵＭＯ蛋白的存在能够增加融合蛋白的表达量，并增逡逑加蛋白的可溶性，而且使用ＳＵＭＯ蛋白酶能够去除融合的ＳＵＭＯ蛋白。逡逑在本研究中，将斑马鱼ｕｂｅｌ基因的全长ＣＤＳ插入Ｓａｉｌ酶切位点，并保证ＯＲＦ对框翻逡逑译。经过诱导表达，将得到６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－Ｕｂｅｌ融合蛋白。经过Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（ＤＮＡ邋Ｓｔａｒ）软件逡逑ＥｄｉｔＳｅｑ组件的运算，发现融合蛋白含有１１８７个氛基酸（ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ，邋ａａ），分子量（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ逡逑Ｗｅｉｇｈｔ，邋ＭＷ）约为邋１３３ｋＤａ，等电点（Ｉｓｏｌｅｃｔｒｉｃ邋Ｐｏｉｎｔ，ＩＰ）约为邋５

洗脱,蛋白,抗体

逡逑图３．８所示为１Ｌ邋Ｅ．ｃｏｌｉ邋ＢＬ２１菌液诱导表达６Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－Ｕｂｅｌ蛋白后，经亲和层析纯化逡逑（ＵＬＰ１酶切洗脱）的结果。与图３．４相比，其蛋白得率要小得多，且非目的蛋白依然含量逡逑较大。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｋ）ｔ结果显示，图３．８中出现的非目的蛋白并非杂蛋白，而是全长Ｕｂｅｌ蛋白逡逑断裂的部分（图３．９，其中，一抗为生物公司生产ａｎｔｉ－Ｕｂｅｌ抗体，二抗为Ｓａｎｔａ邋Ｃｒｕｚ逡逑Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ公司的ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ抗体）。该结果与图３．６和图３．７是一致的，说明在Ｕｂｅ丨蛋逡逑白诱导表达过程中，即部分被降解成小片段。因无法得到纯度较高的Ｕｂｅｌ蛋白，故体外泛逡逑素化实验只能暂时摘置。逡逑／、＜／邋ｙ邋、－逡逑ｋＤａ邋Ｍ邋妒、。、／邋＝／《义逡逑２５０逡逑１５０灥滛逦碰幽！免逦ａ－Ｕｂｃｌ逡逑１００邋ｍｍ逡逑Ｊ邋抽．＊逡逑７５邋（ＨＩ逦W逡逑．ｎｍ邋－鞭：逡逑ｍｍ－逡逑图３．９亲和层析纯化Ｕｂｅｌ蛋白（ＵＬＰＩＳＩ切洗脱）的Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂ丨ｏｔ检测逡逑Ｆｉｇ．邋３．９邋Ｗｅｓｔｅｎ邋ｂｌｏｔ邋ｔｅｓｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋Ｕｂｅｌ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｂｙ邋ａｆｆｉｎｉｔｙ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ逡逑ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＵＬＰｌ邋ｐｒｏｔｅａｓｅ邋ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ邋ｆｏｒ邋ｅｌｕｓｉｏｎ）逡逑３．２．３邋ｕｂｅｌ基因部分表达序列的原核表达系统构建逡逑鉴于体外泛素化研究暂时无法进行，而本实验室另一研工作亟需Ｕｂｅｌ抗体（之前公司逡逑所合抗体大样不工作，小样已用完），故我们打算纯化Ｕｂｅｌ蛋白用于生产抗体。而用于生逡逑产抗体的抗原

【参考文献】