海洋重要病原迟缓爱德华氏菌效应物筛选及EseG转运与定位特征研究

发布时间：2020-08-16 19:47

【摘要】：细菌效应物是细菌与宿主相互作用时转运到宿主中的一类蛋白,大多数为毒力蛋白,能够通过干扰宿主的膜运输、MAPK信号通路、泛素化途径等生理过程使宿主致病。本文研究的迟缓爱德华氏菌是一种重要的海洋病原菌,但是目前关于其效应物的报道甚少。在本课题组的前期研究中发现,迟缓爱德华氏菌在感染小鼠巨噬细胞后,细菌基因转录谱发生了显著变化,这暗示着差异转录基因可能是作为毒力效应因子在感染过程中发挥了重要作用。本课题以这些感染过程中显著变化的120个基因作为潜在的细菌毒力效应因子,利用不同的方法进行了细菌效应物的筛选、鉴定以及功能研究。首先,通过构建效应物与p-内酰胺酶融合表达菌株,利用荧光能量共振转移法,我们进行了初步筛选与鉴定,得到一系列能够转运至宿主细胞的候选效应物；其次,通过免疫荧光和免疫印迹法进一步鉴定了这些候选效应物的转运情况,最终得到ETAE_0247、ETAE_0275、ETAE_0490、ETAE_1303、ETAE_1640、ETAE_2080、 ETAE_2136、ETAE_2188和ETAE_2399这9个新的细菌效应物；然后,考察了这些效应物的胞外分泌情况,发现存在全部分泌、部分分泌和不分泌的特征,从而揭示了效应物分泌机制的多样性以及分泌和转运的非耦联性；再者,从理化性质与功能结构域等多角度对效应蛋白进行了生物信息学分析,发现部分效应物含有信号肽序列和跨膜结构域,暗示这些效应物在宿主中可能具有特殊的定位与功能；最后重点研究了效应物EseG的转运与定位特征。通过细胞松弛素D抑制和胞内转运实验首次证明了效应物EseG的转运依赖细菌内化,即只有胞内的细菌才能将EseG转运至宿主细胞中；通过组分分离和免疫荧光实验首次证明了EseG在宿主细胞中特异性定位在吞噬泡膜上,这种特异性的转运与定位方式表明EseG可能在细菌摄入后发挥功能并且可能与小泡膜的形成有关。本课题的研究鉴定获得了9个新的迟缓爱德华氏菌效应物,并阐明了EseG的胞内转运和定位特征。上述工作为进一步解析这些效应物的功能及迟缓爱德华氏菌的致病机理奠定了基础。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S941.4

【参考文献】