两种鲆鲽鱼类性别相关遗传性状分析及分子标记开发与筛选

发布时间：2020-08-16 21:22

【摘要】：半滑舌鳎和星斑川鲽是我国北方沿海区市场价值较高的鲆鲽鱼类。半滑舌鳎是属于黄渤海特种鱼类,也是近10年来开发的工厂化养殖名贵鱼类。星斑川鲽主要分布于北太平洋,在我国黄海的北部深水处才能找到它的踪迹,其野生资源量非常少。它们与大菱鲆、牙鲆一起已成为我国北方海水鱼类养殖业的主导。本论文从分子遗传育种的实际需求出发,主要进行了以下三个方面的内容:首先对半滑舌鳎真、伪雄鱼母系半同胞家系进行了遗传多样性分析;然后对星斑川鲽进行了微卫星标记开发并对搜索出的微卫星序列进行了特征分析;并对星斑川鲽进行了性别特异微卫星标记筛选。主要有以下研究结果:1.半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系的遗传多样性分析半滑舌鳎养殖群体中存在真雄鱼(ZZ)和伪雄鱼(ZW)现象,其遗传特征进行研究,对于半滑舌鳎育种及优良苗种培育具有重要的意义。本研究以半滑舌鳎真、伪雄鱼群体及母系半同胞家系为研究对象,利用半滑舌鳎22对多态性微卫星标记,对两组半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系群体进行了遗传多样性分析。结果显示:筛选出的22对引物扩增产物均具有多态性,4个半同胞家系群体中共检测到232个等位基因,群体平均等位基因数Na均大于平均有效等位基因数Ne;平均观测杂合度Ho均小于平均期望杂合度He;平均多态信息含量(PIC)分别为0.4566、0.4254、0.5069、0.4795。22个多态性位点在4个半同胞家系群体中分别有3、3、4和5个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡。4个半同胞家系群体间的Nei's遗传距离为0.2101~0.5840,遗传相似性系数为0.5577~0.8105。本文研究表明:半滑舌鳎真、伪雄鱼半同胞家系间的遗传相似系数较高、遗传距离较小,遗传多样性指标相近。2.星斑川鲽微卫星序列的开发及其相关特征分析本研究利用RAD-seq技术对星斑川鲽的雌、雄基因池进行了微卫星序列的搜索,在长度为89810018 bp的星斑川鲽DNA测序序列中,共找到48185个微卫星序列,其中完全型微卫星序列共有36804个,其序列总累积长度占所测序长度的0.82%。检测出的微卫星序列中,有单碱基、二碱基、三碱基、四碱基、五碱基和六碱基6种重复单元类型,在完全型微卫星序列中,二碱基重复类型的微卫星序列数最多,占序列总数的72.79%,其次是三碱基重复类型,占序列总数的10.80%。AC是二碱基重复类型中微卫星序列数最多的重复拷贝类别,占二碱基重复类型序列总数的76.56%。本论文对星斑川鲽微卫星序列的不同重复单元与相应平均拷贝数进行了相关分析,结果显示,微卫星序列重复单元的长度与平均拷贝数呈负相关关系(r=-0.789),说明随着微卫星序列重复单元长度的增加,相应的拷贝数在减少。在1~6碱基重复类型微卫星序列的变异系数统计分析中,二碱基重复类型微卫星序列的变异系数最大,为0.51。同时,本论文对不同重复单元微卫星中的AT含量进行了统计分析,发现其含量与相应微卫星的序列总数、累积长度以及平均拷贝数呈正相关关系,结果说明AT含量的增加,三者的数值均会随着增加。3.星斑川鲽性别相关SSR标记的筛选本研究利用分析对比得到的星斑川鲽雌性或雄性特异且重复次数大于或等于10的26对微卫星引物扫描雌、雄各48个个体的基因组DNA,进行第一次单个体验证,在雌、雄个体中扩增出差异条带引物只有1对。用星斑川鲽雌、雄各96个个体进行第二次扩大样本个体验证。结果显示:引物RAD_PE_through_237042在第二次个体验证中扩增出的差异条带的出现频率在雌、雄个体中具有极显著差异(p㩳0.01),差异等位基因片段在96个雌性个体中出现了29次,频率较高,为30.21%;在96个雄性个体中出现了11次,频率较低,为11.46%。对目的条带切胶回收、克隆和测序后,通过DNASTAR分析比对,发现差异片段比无差异片段少了一个AT重复。由此可知,引物RAD_PE_through_237042的差异片段对星斑川鲽的性别具雌性偏好性,该位点应该与星斑川鲽性别决定区域存在一定关系。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4
【图文】：

DNA琼脂糖凝胶电泳,雄鱼,引物,多态性

图 2-1 部分样本的 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果Figure 1 DNAagarose gel electrophoresis results of some samplesM：DL2000 DNAMarker；1-9：9 个不同的鳍条样品提取的基因组 DNAM: DL2000 DNAMarker; 1-9: the genomic DNAwas extracted from nine different ray samples2.2.2 微卫星扩增图谱利用选择合成的 50 对微卫星引物对 4 个半同胞家系群体进行多态性检测，其中 22 对引物具有多态性。其中引物 scaffold0794994 在 4 个半同胞家系群体中的扩增结果见图 2-2。从电泳图可以看出，相同引物伪雄鱼个体扩增出的条带多态性高于真雄鱼。

群体,引物,雄鱼,多态性

雌雄,引物,条带,频率

图 4-1 引物 RAD_PE_through_237042 在星斑川鲽雌雄各 48 个个体的第一次单个体验证。M为 Marker,48♀为 48 个雌性个体，48♂为 48 个雄性个体。白色箭头所指样本即为出现差异条带的样本。Fig.4-1 Amplification of RAD_PE_through_237042 in 48 individuals of males and females of.Starry flounder4.2.3 差异条带在雌、雄个体中的扩大验证将在星斑川鲽雌、雄各 48 个个体中扩增差异显著的微卫星引物RAD_PE_through_237042 在星斑川鲽雌、雄各 96 个个体中进行 PCR 扩增，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，扩增结果见图 4-3 。图片显示引物RAD_PE_through_237042 在 96 个雌性个体中有 29 个个体扩增出差异条带，频率较高为 30.21%；在 96 个雄性个体中有 11 个个体扩增出差异条带，频率较低为 11.46%，用 SPSS19.0 软件对具有差异条带的 SSR 标记在雌、雄中出现的频率进行卡方检验，得到 P 值为 0.003（小于 0.01）。由此可见，SSR 标记RAD_PE_through_237042 的差异条带在星斑川鲽雌、雄个体中的比例呈极显著

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