条斑紫菜突变株的诱变筛

发布时间：2020-08-18 12:47

【摘要】：条斑紫菜生长在潮间带,主要分布于北太平洋西部,是一种重要的经济海藻。条斑紫菜产业经济效益高,市场前景广阔。然而,条斑紫菜产业目前仍存在周期较长、成本较高、种质退化及病害频发等问题。解决这些问题的核心为育种,即培育具备优良性状的新品种。本文以条斑紫菜优良纯系NA为初始藻株,对其自由丝状体进行了化学诱变,获得了易于膨大形成壳孢子囊枝的突变株E;分别对突变株E的丝状体和叶状体的生理生化特性和组学进行了研究,并实施了育苗和海上试养。主要研究结果如下:(1)突变株E和初始藻株NA丝状体的生理生化特性。显微镜下两个藻株丝状体的形态无明显差异。相同温度下,尤其是18℃,突变株E丝状体比初始藻株NA更容易形成壳孢子囊枝。在18℃下培育突变株E丝状体,使其发育形成壳孢子囊枝,采用低温缩光诱导的方法能够促进壳孢子放散,放散时间约为9d,在5~7 d时达到高峰。其中,16℃下放散量较多,日放散量最高可达(3.15±0.10)×10~7 g~(-1)。用自由丝状体接种贝壳,突变株E的接种率(21.33%±5.33%)低于初始藻株NA(60.44%±3.08%),说明突变株E丝状体不容易钻壳。以壳孢子囊枝比率为参数,研究突变株E营养藻丝的培养条件。结果显示其适宜培养条件为16℃,20μmol photons m~(-2)s~(-1)白色光源,25‰~30‰盐度。(2)突变株E和初始藻株NA丝状体转录组的变化。转录组分析共得到26,949个差异表达基因,包括11,948个上调基因和15,001个下调基因。突变株E丝状体呼吸作用较强,可能是为丝状体的发育提供更多能量。第二信使介导的信号转导较低,但介导激素信号转导的泛素-蛋白酶体途径较强,表明激素可能在突变株E壳孢子囊枝形成过程中发挥重要作用。编码细胞骨架蛋白、转录相关蛋白和氨基酸合成相关蛋白等的基因表达量上调,可能是为突变株E丝状体发育(形成壳孢子囊枝)提供物质基础。(3)突变株E和初始藻株NA叶状体的生理生化特性。显微镜下两个藻株的幼小叶状体(≤10 mm)形态无明显差异。突变株E幼小叶状体的生长速率和增量(0.79±0.05 mm d~(-1)和62.50±12.11)大于初始藻株NA(0.26±0.06 mm d~(-1)和8.00±5.15),表明相同条件下,突变株E叶状体可以释放更多的单孢子。以光合活性为参数,初步研究了条斑紫菜突变株幼小叶状体的培养条件,其适宜培养条件为16℃,60~80μmol photons m~(-2)s~(-1)的白色光源,30‰盐度和碳氮比3:1。将幼小叶状体(~10 mm)转到10℃培养,4 wks后长成较大的叶状体。两个藻株的叶状体均为细长型,肉眼和显微镜下观察其表面观和纵面观无明显差别。与初始藻株NA相比,突变株E叶状体具有生长优势。4 wks后,突变株E叶状体的长度是初始藻株NA的3.5倍,生物量约为NA的3倍。此外,突变株E叶状体的光合参数、部分色素(包括α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量均高于初始藻株NA,而细胞呼吸速率低于初始藻株NA(p0.05)。叶状体失水胁迫实验结果显示,在叶状体细胞持续失水过程中,Fv/Fm,Y(I)以及Y(II)均随之下降。当绝对含水量降至9%时,Y(II)的值接近0。复水15 min后,Y(I)值迅速回升,Fv/Fm和Y(II)也恢复过半。复水1 h后,Fv/Fm和Y(I)基本恢复到原有水平。在此过程中,虽然在某些时间点,突变株E的一些光合参数值高于初始藻株NA,但整体趋势无明显差异。(4)突变株E和初始藻株NA叶状体转录组和蛋白质组的变化。转录组分析共得到1,549个差异表达基因。其中,上调基因657个,下调基因892个。蛋白质组分析共鉴定到41个差异蛋白,包括22个上调蛋白和19个下调蛋白。整合转录组和蛋白质组结果,发现突变株E叶状体内分解代谢前期途径,如糖酵解、磷酸戊糖途径以及丙酮酸降解过程增强,由此推测前期产物乙酰辅酶A含量较高。呼吸电子传递链上电子传递体减少,且测定结果显示细胞呼吸速率较低,表明突变株E叶状体呼吸作用较弱。呼吸作用的降低暗示增加的乙酰辅酶A没有进入三羧酸循环进一步分解,而是作为前体参与了脂肪酸的合成。除此之外,突变株E叶状体内一些与光合作用、蛋白合成相关的基因和蛋白上调,且测定结果显示突变株E的光合参数、色素含量和生物量高于初始藻株NA,这表明突变株内的合成代谢如光合作用、蛋白质合成等途径较强。分解代谢较低而合成代谢较高,这可能是突变株E叶状体生长速率较快的原因。此外,多种抗逆蛋白(如热激蛋白、抗氧化剂等)表达量增加,表明条斑紫菜突变株E具有高效抗逆的潜力。(5)在日照华岚紫菜育苗厂分别接种了突变株E和初始藻株NA的自由丝状体,接种密度为600段/cm~2。丝状体生长初期的培养条件为18.5~20℃,最高光强4000 lx,盐度24.8~26.5‰。之后培养条件为23~26℃,最高光强2500 lx,盐度24.8~26.5‰。此过程中,丝状体膨大发育为壳孢子囊枝,后者成熟后释放壳孢子。统计壳孢子放散量,发现突变株E的壳孢子放散总量大于初始藻株NA,日放散量最高可达240.15±21.83万个/壳。(6)使用铺网泼水式采苗,突变株E和初始藻株NA各采两张网,分别挂到威海文登紫菜养殖区(36°47'54''N 121°58'03''E)和日照岚山港潮间带(35°5'24''N 119°18'00''E)进行海上试养。威海试养的叶状体生长状态良好,突变株E和初始藻株NA长度、宽度没有明显差异,突变株E的Fv/Fm、Y(I)、Y(II)以及大部分光合色素(玉米黄素、叶绿素a、β-胡萝卜素、藻红蛋白和藻蓝蛋白)含量高于初始藻株NA(p0.05)。而且网绳上试验苗的密度高于养殖区其他条斑紫菜,这可能是因为其放散单孢子的能力较强。营养成分分析结果显示,条斑紫菜叶状体中含量较高的为碳水化合物(40.8~41.0 g/100 g DW)和蛋白质(36.8~37.1 g/100g DW),其次是灰分(18.3~19.3 g/100 g DW),此外还含有少量的粗纤维(3.5 g/100g DW)和脂肪(1.2~1.6 g/100 g DW)。与初始藻株NA相比,突变株E叶状体的碳水化合物、蛋白质及脂肪含量较高。与三种代表性谷物(小麦、稻米和黄豆)营养成分相比,条斑紫菜为高蛋白质低脂肪的绿色健康食品。氨基酸组成分析结果共测得18种氨基酸的含量,包括8种必需氨基酸和10种非必需氨基酸。其中,甲硫氨酸和胱氨酸为试养的条斑紫菜叶状体中的限制性氨基酸。除甲硫氨酸和异亮氨酸外,条斑紫菜突变株E叶状体内其他氨基酸(包括9种呈味氨基酸)的含量均高于初始藻株NA。呈味氨基酸中甜味类和鲜味类氨基酸总量在所测氨基酸总量中超过50%。脂肪酸分析共检测到14种脂肪酸,包括3种饱和脂肪酸、6种单不饱和脂肪酸和5种多不饱和脂肪酸。突变株E叶状体中总脂肪酸含量和单项脂肪酸的含量均高于初始藻株NA。日照试养的突变株E叶状体的密度、长度、光合活性以及色素含量均大于初始藻株NA(p0.05)。水质检测发现,日照养殖区缺氮缺磷,威海养殖区缺氮。在同样缺氮的情况下,两个养殖区试养的条斑紫菜生长情况具有明显差异,可能受不同环境和养殖方式的影响。日照养殖区海上试养后期,初始藻株NA和养殖区其他条斑紫菜出现腐烂脱网等现象,而突变株E叶状体生长状态较好,颜色较深,韧性较强。这表明在营养缺乏条件下,条斑紫菜突变株E叶状体的适应能力更强。本研究通过自由丝状体的化学诱变获得了条斑紫菜突变株E,其丝状体易于膨大形成壳孢子囊枝,叶状体生长速率高于初始藻株NA。分析突变株E和初始藻株NA丝状体及叶状体组学的变化,发现突变株E丝状体内第二信使介导的信号转导较低,但介导激素信号转导的泛素-蛋白酶体途径较强,表明激素可能在条斑紫菜突变株丝状体形成壳孢子囊枝方面发挥重要作用;突变株E叶状体合成代谢较强,分解代谢较弱,这可能是其叶状体生长速率较快的原因。研究中的组学数据为条斑紫菜分子育种提供了理论基础。同时,本研究还进行了条斑紫菜突变株E的育苗及海上试养,为今后的人工栽培积累了实践经验。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.3
【图文】：

紫菜,生活史,条斑紫菜,营养价值

图 1.1 紫菜生活史(王旭雷等，2017)Figure 1.1 The life history of Pyropia/Porphyra条斑紫菜的营养价值及人工栽培条斑紫菜的营养价值条斑紫菜味道鲜美，营养价值高，是天然的海洋珍品。紫菜是高蛋白，蛋白质含量最高可达 50%，且富含多种人体必需的氨基酸，而脂肪含～3%。此外，条斑紫菜还含有多种膳食纤维、维生素（维生素 A，B 物质元素（镁、钙、铁、锌、碘等）（Rao etal.,2007; 张全斌等,200此，条斑紫菜体内的活性物质还具备保健功效和药用价值。研究表明中的牛磺酸对婴儿的生长发育，尤其是大脑发育具有促进作用（王芬

条斑紫菜,藻丝

图 2.1 条斑紫菜单藻丝Figure 2.1 A filament of Py. yezoensis讨论的条斑紫菜丝状体细胞致死率变剂量试验结果显示，虽然对照组的无水乙醇对条斑的损伤，但与 EMS 相比，这种损伤较小，可以不予考，除了 0.1 M EMS 的四个处理和 0.2 M EMS 30 min的细胞死亡率均超过 50%。表 2.2 显示，2wks 后，除外，其余处理条件下的细胞死亡率均超过 50%。如果0.1 M EMS 的 4 个处理和 0.2 M EMS 30 min 处理之外。在此基础上，比较两表中的数据，发现 5 组处理条

丝状体,诱变,条斑紫菜,生长情况

图 2.2 条斑紫菜诱变丝状体的生长情况诱变条件下的丝状体；b, 0.2 M EMS 60min 处理的 E、F3 和 C6 丝状Figure 2.2 The growth of mutagenic conchocelis of Py. yezoensishocelis under other mutagenic conditions; b, conchocelis of E, F3 and C6EMS 60min

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