长牡蛎血淋巴细胞分子标记AATase、SOX11和CD9 antigen的鉴定

发布时间：2020-08-19 08:39

【摘要】：血淋巴细胞是无脊椎动物固有免疫系统的核心和基础,是机体免疫防御的重要执行者。不同亚型血淋巴细胞的形态结构、免疫功能及分子特征差异显著。依据血淋巴细胞大小、核质比,及颗粒度等形态特征,结合光学显微镜和流式细胞术,长牡蛎血淋巴细胞被分为无粒细胞、半粒细胞和颗粒细胞。但三类亚型血淋巴细胞的具体分子特征尚不清楚。本研究以长牡蛎为研究对象,在血淋巴细胞形态分类和单细胞转录组数据的基础上,筛选获得颗粒细胞的分子标记乙醇乙酰转移酶(命名为CgAATase)和转录因子SOX11(命名为CgSOX11);无粒细胞的分子标记CD9 antigen(命名为CgCD9 antigen)。利用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、Western Blot、免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)、亚细胞定位、单克隆抗体技术及免疫磁珠法等分子生物学和细胞生物学技术,对CgAATase、CgSOX11和Cg CD9 antigen的分子特征和特异性表达模式进行了鉴定。主要取得以下结果:分析三类血淋巴细胞亚群的单细胞转录组数据,发现CgAATase在颗粒细胞中显著性高表达。获得CgAATase基因的核苷酸序列,CgAATase基因的编码框含有1431个碱基(bp),编码476个氨基酸,理论分子量为54.5kDa,结构分析发现CgAATase含有经典的AATase结构域。CgAATase显著高表达于血淋巴细胞,其表达水平为肝胰腺的37.31-fold(p0.05);在三类亚型血淋巴细胞中,CgAATase显著高表达于颗粒细胞,表达水平分别为半粒细胞和无粒细胞的2.83-fold(p0.05)和8.50-fold(p0.05),在无粒细胞中表达量最低。灿烂弧菌(Vibrio splendidus)刺激可显著诱导CgAATase mRNA的表达上调,刺激后6小时CgAATase的mRNA表达水平达到最大值,为对照组的27.40倍(p0.05)。利用大肠杆菌(Escherichia coli)原核表达系统获得CgAATase的重组蛋白,利用杂交瘤技术制备CgAATase的单克隆抗体。ELISA结果显示单克隆抗体1E10呈差异性表达,在颗粒细胞中有较强的阳性信号,阳性值为1.078;在半粒细胞中阳性值较低为0.229;而在无粒细胞中无阳性值。发现CgAATase主要分布在颗粒细胞的细胞膜。结合免疫磁珠法和流式细胞仪,单克隆抗体1E10可以对颗粒细胞进行有效的分离,分离纯度高达85.7±4.60%。发现颗粒细胞在体外培养一周后,颗粒细胞仍具有较好的细胞活性,光学显微镜下可明显观察到细胞延伸出的丝状伪足。上述结果表明CgAATase特异性分布在颗粒细胞表面,可作为颗粒细胞的分子标记。克隆获得了CgSOX11基因的编码框区域,CgSOX11基因的编码框含有1020bp,编码339个氨基酸,理论分子量为38kDa。CgSOX11含有保守的HMG盒子结构域。CgSOX11的HMG盒子区域及C-末端与脊椎动物和模式物种的相似度高达80%。进化树分析结果表明长牡蛎CgSOX11与虾夷扇贝MySOX11聚为一支,归为无脊椎动物类。CgSOX11mRNA在血淋巴细胞和鳃中表达量较高,分别为唇瓣的2.78-fold(p0.05)和1.95-fold(p0.05);在三类亚型血淋巴细胞中,CgSOX11mRNA在颗粒细胞中的表达水平分别为无粒细胞和半粒细胞19.14-fold(p0.05)和17.26-fold(p0.05)。V.splendidus刺激后CgSOX11 mRNA表达水平显著上升,在刺激后3小时达到最高值,为对照组的8.03-fold(p0.05)。利用E.coli原核表达系统获得CgSOX11重组蛋白,免疫Balb/C小鼠获得多克隆抗体。通过Western Blot分析在血淋巴细胞中检测到明显的2条显色带(约38kDa和50kDa)。其中38kDa处的蛋白与预期目的蛋白大小一致。血淋巴细胞与SUMO1,2,3单克隆抗体孵育发现,Western Blot和IP实验检测到50kDa的特异性显色带,推测CgSOX11在体内可能发生SUMOylation修饰。CgSOX11和SUMO蛋白主要分布于血淋巴细胞细胞核上。结合免疫磁珠法和流式细胞术,CgSOX11多克隆抗体可以对颗粒细胞进行有效分离,采用负向分选的方法,可以看到颗粒细胞明显的缺失,分离纯度为81.2%。上述结果表明CgSOX11可以作为颗粒细胞的分子标记。分析长牡蛎基因组序列信息,得知CgCD9 antigen含有693bp,编码230个氨基酸,理论分子量为25kDa,发现CgCD9 antigen含有经典的四次跨膜(Tetraspannin)结构域。将体外合成的CgCD9 antigen大环胞外段的11aa作为免疫原免疫Balb/C小鼠,利用杂交瘤技术制备CgCD9 antigen单克隆抗体。ELISA实验表明单克隆抗体3D8与无粒细胞具有较高的特异性,特异性值为1.596(P/N2.1),与半粒细胞和颗粒细胞具有较低或无特异性,单克隆抗体3D8为CgCD9 antigen的特异性抗体。亚细胞免疫荧光实验表明CgCD9 antigen主要分布于无粒细胞的细胞膜。结合免疫磁珠法和流式细胞术,单克隆抗体3D8可以对无粒细胞进行高纯度分离,纯度为86.9±2.90%。对分离出的无粒细胞进行体外培养,培养一周后,无粒细胞仍具有较好的细胞活性。上述结果表明CgCD9 antigen可以作为无粒细胞的分子标记物,为识别无粒细胞提供了分子基础。综上所述,CgAATase和CgSOX11在颗粒细胞中特异性高表达,CgAATase主要分布于颗粒细胞的细胞膜上,成功获得CgAATase单克隆抗体1E10,分离出高纯度且具有活性的颗粒细胞;CgSOX11主要分布于颗粒细胞的细胞核中,可能通过SUMOylation行使免疫功能,获得其多克隆抗体,分离出高纯度的颗粒细胞;CgCD9 antigen在无粒细胞中特异性高表达,且位于无粒细胞的细胞膜上,成功获得CgCD9 antigen单克隆抗体1E10,且分离出高纯度且具有活性的无粒细胞。这些研究结果在细胞和分子水平丰富了当前对长牡蛎颗粒细胞和无粒细胞的认知和鉴定,为研究血淋巴细胞的发生、发育、免疫功能及调控机制提供了良好的借鉴。
【学位授予单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

氨基酸序列,长牡蛎,结构域,颗粒细胞

记 CgAATase 的鉴定及颗粒细胞的分离Tase 的分子特征颗粒细胞的特异性基因，在颗粒细胞上调表达的基因中，对相为：在颗粒细胞中显著性高表达，且位于细胞膜，为后续活性胞的体外培养提供条件。筛选发现 CgAATase 基因在颗粒细胞粒细胞的 8.26 倍（p < 0.05）和半粒细胞的 2.14 倍（p < 0.05）ank 数据库（Accession No. XM_020065799）中下载得到 CgA并据此推导出相应的氨基酸序列和蛋白序列。CgAATase 基因，编码一条由 476 个氨基酸组成的多肽，其理论分子量为 54.5kMART 预测显示 CgAATase 含有一个经典 AATase 的结构域，个氨基酸处（图 3-1，图 3-2）。

氨基酸序列,长牡蛎,代表结构,灰色

28图 3-2 长牡蛎 CgAATase 的氨基酸序列，灰色部分代表结构域Fig 3-2 The amino acid sequence of CgAATase, The AATase domain is shadowed.AATase 的表达特征荧光实时定量 PCR 对 CgAATase 的组学数据进行验证，检测了 CgAA、鳃、唇瓣、外套膜、性腺、神经节、肌肉柱和肝胰腺，及在颗粒细胞细胞中的表达情况。结果显示，CgAATase 在血淋巴细胞中显著性高表

长牡蛎,组织分布,转录水平,粒细胞

1.13-fold(p>0.05)和 0.35-fold(p>0.05)，无差异性表达 (图3-3)。图 3-3 长牡蛎 CgAATase 转录水平的组织分布Fig 3-3 Tissue distribution of CgAATase mRNA实验室前期研究，利用 Percoll 密度梯度离心，将血淋巴细胞在 Percoll 分离液（30%/55%）中被分为三层，无粒细胞主要位于上层，半粒细胞主要位于中间层，颗粒细胞则大部分位于底层，分别占总血淋巴细胞的 32.27±2.61%、40.01±1.92%和 27.63±1.60%[17]。本研究利用 RT-PCR 对 CgAATase 在三类血淋巴细胞亚群中的表达水平进行了检测。结果显示，CgAATase 在颗粒细胞中表达量最高，分别是半粒细胞和无粒细胞表达量的 2.83-fold 和 8.50-fold (p < 0.05)，在无粒细胞中表达量最低，与单细胞测序结果一致（图 3-4）。

【参考文献】